Práctica: cromatografía por filtración en gel

“RESUMEN”

La cromatografía es un método empleado en la separación de mezclas complejas y ésta tiene aplicación en muchas ciencias, existen diversos métodos cromatográficos, entre ellos el método de filtración en gel que se aplica en esta práctica. Esta técnica es un proceso en el cual se separan moléculas de acuerdo a su tamaño molecular. En este caso la capacidad de separación de lasmoléculas que tiene el gel, el cual deja pasar (por sus poros) las moléculas de iguales pesos moleculares, pero también se debe tomar en cuenta que el tamaño de los poros depende del gel o la fase estacionaria. El objetivo la práctica es separar molecular por su tamaño molecular por medio de una cromatografía con el instrumento cuyas características son: 1 metro de longitud, 2.5 de diámetro ycapacidad (volumen) de 500mL, así pues, determinar los parámetros correspondientes que determinan el comportamiento de la molécula de azul de dextran.

“INTRODUCCIÓN”

La cromatografía por filtración en gel o de exclusión por tamaño es un método cromatográfico en fase líquido- sólido, en el cual la fase estacionaria es un material poroso inerte (en este caso el gel), el cual permite ladiscriminación o exclusión entre los solutos de acuerdo a su tamaño y en algunos casos de acuerdo a su estructura molecular.

Las moléculas de gran tamaño, no pueden penetrar directamente los poros hacia la fase estacionaria sólida (discriminación global), por lo tanto son excluidos y por consiguiente éstos viajan en el frente de la fase móvil. Obviamente las moléculas de menos tamaño pueden penetrardirectamente los poros de la fase y penetrar al interior del material (discriminación precisa). Por lo tanto las moléculas de mayor tamaño siempre tienen un mayor recorrido para poder llegar a la fase móvil, por lo tanto más tiempo en la columna.

Factores que influyen en la separación

Además de la diferencia intrínseca de tamaño existente entre las moléculas que van a ser cromatografiadas, haydiferentes factores que influyen en una correcta separación de las mismas:

- Longitud de la columna; La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño aumenta con la longitud de la columna.

- Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1.- El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeño comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total.

- Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado homogéneamente en lacolumna o se encuentra excesivamente comprimido.

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OBJETIVO

Entender el fundamento de la cromatografía de filtración en gel por medio de la sola filtración de azul de dextran .

MATERIAL

▪ Tubos de Ensaye
▪ Pipetas Automáticas
▪ Pipeta Pasteur

REACTIVOS

▪ Agus destilada
▪ Azul de dextran
▪ Biogel P-100
METODOLOGÍA

Primeramente para podercomenzar la práctica de deben tomar aspectos de seguridad, así como de conocimiento acerca de la misma, teniendo esto como requisito primordial se procede a armar el equipo a utilizar en la práctica para después adentrarse con la técnica como sigue:

1) Se lleva a cabo la preparación del gel, pesando 33.33 gramos de gel en polvo y adicionando 15 ml de agua por cada gramo del gel en polvo, paratener como resultado 500mL que es el volumen requerido para llenar la columna del Biogel P-100.

2) Se espera hasta que la columna esté fija y se agrega agua constantemente si no se está utilizando para que no se seque el gel. Después de que el que se consumió el agua del tubo, se procede a agregar el analito, en este caso azul de dextran y se espera hasta que este penetre la capa del...