pract 2 mole
Páginas: 8 (1955 palabras)
Publicado: 29 de junio de 2015
INTRODUCCIÓN
En la biología molecular, la cuantificación de ácidos nucleicos se realiza con frecuencia para determinar las concentraciones medias de ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Las reacciones que utilizan ácidos nucleicos a menudo requieren una cantidad y pureza para un rendimiento óptimo en particular. Hay varios métodos para establecer la concentración de unasolución de ácidos nucleicos, incluyendo la cuantificación espectrofotométrica UV y de fluorescencia en presencia de un tinte de ADN.
La prueba espectrofotométrica
Los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta en un patrón específico. En un espectrofotómetro, una muestra se expone a la luz ultravioleta a 260 nm, y un foto-detector mide la luz que pasa a través de la muestra. Cuanto más luz absorbidapor la muestra, mayor es la concentración de ácido nucleico en la muestra.
Uso de la Ley de Beer Lambert: es posible relacionar la cantidad de luz absorbida a la concentración de la molécula que absorbe. En una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para el ADN de doble cadena es -1 0.020 cm-1, para el ADN monocatenario es -1 0.027 cm-1, para ARN de cadena sencilla que es0,025 cm -1- 1 y para cortos oligonucleótidos de cadena sencilla que es dependiente de la longitud y la composición de base. Por lo tanto, una densidad óptica de 1 corresponde a una concentración de 50 g/ml de ADN de doble cadena. Este método de cálculo es válido para un máximo de un diámetro exterior de al menos 2. Un coeficiente de extinción más precisa puede ser necesaria para losoligonucleótidos, los cuales se pueden predecir usando el modelo del vecino más cercano.
Pureza de la muestra
Es común que las muestras de ácido nucleico de estar contaminados con otras moléculas. La relación de la absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para el ADN puro, A260/280 es ~ 1,8 y para ARN puro A260/280 es ~ 2.
Contaminación de proteínas y la relaciónde 260:280
La relación de absorción a 260 nm frente a 280 nm se usa comúnmente para evaluar la contaminación de ADN de soluciones de proteínas, ya que las proteínas absorben luz a 280 nm. La inversa, sin embargo, no es cierto que se necesita una cantidad relativamente grande de contaminación de proteína para afectar significativamente la relación de 260:280 en una solución de ácido nucleico.260:280 relación tiene una alta sensibilidad para la contaminación de ácido nucleico en proteína
260:280 relación carece de sensibilidad para la contaminación de proteínas en ácidos nucleicos
Esta diferencia se debe al coeficiente de extinción mucho más altos ácidos nucleicos tienen a 260 nm y 280 nm, en comparación con la de las proteínas. Debido a esto, incluso para concentraciones relativamentealtas de proteína, la proteína contribuye relativamente poco a la absorbancia 260 y 280. Mientras que la contaminación de la proteína no se puede evaluar con fiabilidad con una relación de 260:280, esto significa también que contribuye poco error de estimación cantidad de ADN.
Otros contaminantes comunes
La contaminación por fenol, que se utiliza comúnmente en la purificación de ácido nucleico,puede lanzar significativamente fuera de estimaciones de cuantificación. El fenol absorbe con un pico a 270 nm y un A260/280 de 1,2 - preparaciones de ácido nucleico no contaminados por fenol deben tener un A260/280 de alrededor de 2. La contaminación por fenol puede contribuir significativamente a la sobreestimación de la concentración de ADN.
La absorción a 230 nm puede ser causada por lacontaminación por iones fenolato, tiocianatos, y otros compuestos orgánicos. Para una muestra de ARN puro, la A230: 260:280 debe estar alrededor de 01:02:01, y para una muestra de ADN puro, la A230: 260:280 debe estar alrededor de 1:1.8:1.
La absorción a 330 nm y más altas indica partículas contaminantes de la solución, provocando dispersión de la luz en el rango visible. El valor en una muestra de...
En la biología molecular, la cuantificación de ácidos nucleicos se realiza con frecuencia para determinar las concentraciones medias de ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Las reacciones que utilizan ácidos nucleicos a menudo requieren una cantidad y pureza para un rendimiento óptimo en particular. Hay varios métodos para establecer la concentración de unasolución de ácidos nucleicos, incluyendo la cuantificación espectrofotométrica UV y de fluorescencia en presencia de un tinte de ADN.
La prueba espectrofotométrica
Los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta en un patrón específico. En un espectrofotómetro, una muestra se expone a la luz ultravioleta a 260 nm, y un foto-detector mide la luz que pasa a través de la muestra. Cuanto más luz absorbidapor la muestra, mayor es la concentración de ácido nucleico en la muestra.
Uso de la Ley de Beer Lambert: es posible relacionar la cantidad de luz absorbida a la concentración de la molécula que absorbe. En una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para el ADN de doble cadena es -1 0.020 cm-1, para el ADN monocatenario es -1 0.027 cm-1, para ARN de cadena sencilla que es0,025 cm -1- 1 y para cortos oligonucleótidos de cadena sencilla que es dependiente de la longitud y la composición de base. Por lo tanto, una densidad óptica de 1 corresponde a una concentración de 50 g/ml de ADN de doble cadena. Este método de cálculo es válido para un máximo de un diámetro exterior de al menos 2. Un coeficiente de extinción más precisa puede ser necesaria para losoligonucleótidos, los cuales se pueden predecir usando el modelo del vecino más cercano.
Pureza de la muestra
Es común que las muestras de ácido nucleico de estar contaminados con otras moléculas. La relación de la absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para el ADN puro, A260/280 es ~ 1,8 y para ARN puro A260/280 es ~ 2.
Contaminación de proteínas y la relaciónde 260:280
La relación de absorción a 260 nm frente a 280 nm se usa comúnmente para evaluar la contaminación de ADN de soluciones de proteínas, ya que las proteínas absorben luz a 280 nm. La inversa, sin embargo, no es cierto que se necesita una cantidad relativamente grande de contaminación de proteína para afectar significativamente la relación de 260:280 en una solución de ácido nucleico.260:280 relación tiene una alta sensibilidad para la contaminación de ácido nucleico en proteína
260:280 relación carece de sensibilidad para la contaminación de proteínas en ácidos nucleicos
Esta diferencia se debe al coeficiente de extinción mucho más altos ácidos nucleicos tienen a 260 nm y 280 nm, en comparación con la de las proteínas. Debido a esto, incluso para concentraciones relativamentealtas de proteína, la proteína contribuye relativamente poco a la absorbancia 260 y 280. Mientras que la contaminación de la proteína no se puede evaluar con fiabilidad con una relación de 260:280, esto significa también que contribuye poco error de estimación cantidad de ADN.
Otros contaminantes comunes
La contaminación por fenol, que se utiliza comúnmente en la purificación de ácido nucleico,puede lanzar significativamente fuera de estimaciones de cuantificación. El fenol absorbe con un pico a 270 nm y un A260/280 de 1,2 - preparaciones de ácido nucleico no contaminados por fenol deben tener un A260/280 de alrededor de 2. La contaminación por fenol puede contribuir significativamente a la sobreestimación de la concentración de ADN.
La absorción a 230 nm puede ser causada por lacontaminación por iones fenolato, tiocianatos, y otros compuestos orgánicos. Para una muestra de ARN puro, la A230: 260:280 debe estar alrededor de 01:02:01, y para una muestra de ADN puro, la A230: 260:280 debe estar alrededor de 1:1.8:1.
La absorción a 330 nm y más altas indica partículas contaminantes de la solución, provocando dispersión de la luz en el rango visible. El valor en una muestra de...
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