Practica hidrolisis

PRACTICA No. 3

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA VEGETAL

OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrológicas durante la germinación por el método colorimétrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimática.

MATERIAL:
-tubos de ensayo de (16 x 150)
-gradillas
-pipetas graduadas de 1ml (plástico)
-pipeta de 5 o 10 ml
-vaso de precipitado de 250 ml
-mechero
-soporteuniversal con anillo
-embudo de plástico
-mortero de porcelana con pistilo
-vaso de precipitado
-pipeta de 1 ml
-balanza granataria
-espectrofotómetros
-Celdas
-Semillas de maíz, frijol o lenteja de 7-8 días de germinación
-plumón indeleble.
-jabón y franela para limpiar
-hielo
-sobres de gasa
-Masking tape
-ligas

REACTIVOS:
-solución de glucosa al 0.1 %
-agua destilada
-acido3,5- Dinitrosalicilico (DNS) en frasco ámbar
-solución de yodo (I2KL en una solución de HCL 0.05 N) en frasco ámbar.
-Solución de CaCl2 20 mM – NaCl 200 mM
-solución de almidón al 0.2%
-solución Buffer pH 5

En esta parte de la práctica habrá 5 equipos en los cuales dos trabajaron con amilasa extraída, dos con amilasa pura y el último equipo hará la curva de calibración de glucosa.METODO:
1. Se le quito la parte más blanca de la semilla que sería la raíz y parte del tallo, de todo tipo de semillas y lavarlas para quitar las impurezas, se pusieron todo dentro de un recipiente y se peso en la balanza granataria...
2.-Se molió todo dentro del mortero usando como solvente 3 mililitros de agua destilada por cada gramo de tejido.
3.-Se filtro la molienda con ayuda del embudo y dedos capas de gasa.
4.-Se paso lo filtrado en un tubo de ensaye. Y se dejo sedimentar, manteniéndolo a una temperatura más baja que la ambiente, con ayuda de hielo.
5.-Se diluyo lo obtenido en una solución 1: 10 con solución amortiguadora de acetato pH 5, pero se siguió manteniendo frio.
6.-Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera:

|Tubo|Almidón 0.2% en buffer pH 5 |Solución CaCl-NaCl |
|A y B |4ml |4ml |

[pic]

ENSAYO A
1.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo.
2.-A un tubo se le agrego 3ml de agua destilada, a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica).
3.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima diluida (extraída) a cada tubo que tiene la solución de yodo, en otras palabras por cada 5 minutosdespués del primero que era en tiempo 0, se fue agregando a cada tubo 1 ml de la enzima, con mucho cuidado para no afectar el rango de tiempo.
4.-Agitar
5.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo.
6.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm. En el cual el tubo blanco (paso 2) seutilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados.
7.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción, y se correlaciono con el cambio de color de la serie B.

RESULTADOS:
|TUBO |0 |1 ||C y D |4ml |4ml |

ENSAYO C
1.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo.
2.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada, a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de...