PRACTICA N 2 DE BIOQUIMICA METABOLICA



Objetivo:
El alumno comprobara la conversión de ácido succínico a fumárico, por la acción de la succinato deshidrogenasa, utilizando azul de metileno como aceptor de electrones, e identificaraesta reacción como parte del ciclo de Krebs.
Fundamento:
El succinato se oxida a fumarato mediante la succinato deshidrogenasa. El aceptor de hidrógeno es el FAD, en vez del NAD+. Que es el utilizado enlas otras tres reacciones de oxidación del ciclo.
Por cada vuelta del ciclo se producen: un ATP, tres NADH + H+ y un FADH2, estas últimas moléculas darán lugar a la formación de más moléculas de ATP,durante la fosforilación oxidativa.

Material:
10 tubos de ensaye.
1 tina galvanizada.
2 pipetas graduadas de 5ml.
2 pipetas graduadas de 1ml.
2 matraces volumétricos de 50ml.
1 gradilla.
Equipo:
1parrilla eléctrica
1 termómetro
Reactivos:
Suspensión de levadura al 10%
Solución de ácido succínico 0.5 M
Solución de ácido malónico 1 M
Aceite de inmersión ó aceite mineral
Solución de glucosa 0.5 MAzul de metileno al 0.1%
Agua destilada c.b.p.
Procedimiento:
1. Etiquetar 4 tubos de ensaye como A, B, C y D.
2. Prepararlos de la siguiente manera:

Tubo
A
B
C
D
H2O destilada
3 ml
-
-
-Suspensión de lavadura

-
3 ml
3 ml
3 ml
Glucosa 0.5 M
-
1 ml
1 ml
1
Ácido succínico 0.5 M

-

1 ml

-

0.5
Ácido malónico 1 M

-

-

1 ml

0.5

3. Agregar 2 gotas de azul de metileno 0.1% a cada tubo.Sostener con los dedos cada tubo y mezclar, continúe agregando la tintura de azul de metileno gota a gota (mezclar bien al agregar) hasta que la solución se torne a un azul ligero.
4. sostenga cada tubohaciendo un ligero ángulo, vierta aproximadamente 1 ml. De aceite de inmersión, haciéndolo bajar desde el borde, formando un película sobre la solución. ( El aceite de inmersión, previne que el oxígenose difunda dentro de la solución).
5. Colocar los tubos a baño maría a 37°C.
6. Examinar los tubos transcurridos 40 min. Observe el cambio de color, si lo hay o no y anote los resultados de la...