Protocolo 2d

Protocolos para 2D-PAGE

Extracción de proteínas desde cultivo celular:

Retirar el medio de cultivo de las células CHSE-214 (monocapa) y lavar 2 veces con solución isotónica Tris-HCl 10 mM pH7.0, sacarosa 250 mM para retirar restos de medio. Cosechar las células con un cell scraper y resuspender en la misma solución de lavado. Pelletear bajo centrifugación a 900 g por 10 min a 4°C. yresuspender/lisar en buffer de extracción. Antes de la lisis, extraer toda la solución de lavado. Dejar reposar los homogenados por 30 min en hielo y centrifugar a 14000 rpm por 10 min para separar losrestos insolubles. Traspasar las proteínas solubles a un tubo limpio.

Buffer de extracción 1:

| |Buffer |Stock|
|Tris-HCl pH 7,4 |10 mM |50 mM |
|PMSF|2 mM |257 mM |
|EDTA |2 mM|500 mM |
|Cocktel Inhibidor de Proteasas Sigma |2 mM ||
|DTT |1-2 mM |1 M |
|Tritón X-100|0,5 % |100 % |


Buffer de rehidratación para la 1° dimensión:

| |Buffer|
|Urea |8 M |
|CHAPS |2 % p/v...