Proyecto de investigación - Levadura

Resumen:
Al llegar el fin de curso, todo lo aprendido en el laboratorio se pone a prueba. A través del año, aprendimos nuevas técnicas que se ponen a uso en el trabajo de investigación, como la centrifugación, la espectrofotometría y la electroforesis. La centrifugación es un método de separación una sustancia homogénea a una heterogénea a través de movimientos giratorios. En este caso, elresultado de centrifugación es el “pellet” en donde se encuentra el ADN, o material genético. También se utiliza la espectrofotometría, el cual consiste de luz ultra violeta, para determinar la absorbancia de ondas cercanas. En este laboratorio se utilizo la proporción OD 260 nm / OD 280 nm para determinar pureza de la concentración. El ultimo método que utilizamos es el de la electroforesis paradeterminar la concentración de ADN en la sustancia mediante el aislamiento de proteínas y otras macromoléculas. Con el uso de estos métodos se podría demostrar la manera mas efectiva de extracción de ADN y determinar su pureza. Para poder llevar a cabo la investigación, se utilizo la levadura Candida Kefyr como la variable independiente, y como variables dependientes se utilizo un kit de extracción deADN y un método casero. El grupo decidió que el método del kit de extracción seria mas efectivo que el método casero. No se pudo obtener ningún resultado, ya que hubo un fallo en la micropipeta al usar la técnica de la electroforesis en el gel de agarosa.
[I] Introducción:
En el siguiente experimento se busca investigar que proceso es más efectivo para aislar el DNA y mantener su pureza, elmétodo convencional o el “Yeast DNA extraction kit” de Thermo Scientific. Igual se busca comprobar o rechazar nuestra hipótesis, la cual consiste en que el “Yeast DNA extraction kit” es más efectivo a la hora de extraer el DNA de la levadura ya que es eficaz sin tratamiento enzimático y produce poca o ninguna contaminación de RNA independientemente de la presencia de RNasa. Existen diversos tipos delevaduras usadas para la extracción y cuantificación de DNA que nos ayudarían a comprobar la hipótesis. Para esta investigación se utilizará la levadura Candida Kefyr. Ésta es un género de levaduras (hongos) frecuentemente hallado sobre la piel y en el sistema gastrointestinal; es un patógeno emergente. Raramente causa infecciones en seres humanos pero se ha encontrado que causa infecciones enheridas por quemaduras, infecciones en los pulmones, en las uñas, en la sangre y en la vagina. Se encuentra en productos lácteos.
Para que el experimento sea exitoso se utilizará el proceso de espectrofotometría para medir la absorbancia y determinar la pureza de la levadura y luego se pasará a el proceso de electroforesis en gel de agarosa, el cual es un método que se emplea para separarmacromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.
[II] Metodología Extracción de DNA (Kit)
Para llevar a cabo la extracción, es necesario seguir los siguientes pasos. El primer paso es añadir 2mL del cultivo líquido de levaduras a un microtubo y centrifugarpor 3 minutos a 4,000rpm. Después, se descarta el sobrenadante, ya que contiene mayormente medio de cultivo. Se repiten los primeros tres pasos y se añade 15µl del reactivo Y-PER y se mezcla con vortex por 30 segundos. El próximo paso a seguir es incubar por 10 minutos a 650C. Luego se centrifuga a máxima velocidad por 5 min. Se descarta el sobrenadante y se le añade 400ul del Reactivo A y 400ulReactivo B. Después, se mezcla el contenido y se incuba nuevamente por 10 min a 650C. El próximo paso es añadir 200ul del Reactivo Protein Removal y mezclar varias veces y centrifugar nuevamente a máxima velocidad por 5 minutos. Luego, se transfiere el sobrenadante, ya que contiene el DNA, a un microtubo nuevo de 1.5 ml. Después, se le añade 600 µl de isopropanol y se mezcla invirtiendo el...