Purificación Y Análisis De Acidos Nucleícos

“PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE ACIDOS NUCLEÍCOS”




















































INTRODUCCION

En 1869, el Biólogo y medico Suizo Freidrich Miescher, descubrió los ácidos nucleicos. Meischer aisló de los núcleos de las células una sustancia ácida a la que llamó nucleína, nombre que posteriormente se cambió a ácido nucleico.En 1944 Avery demostró que esta biomolecula era la portadora de la información genética.
Los ácidos nucleicos son macromoléculas, polímeros formados por la repetición de monómeros llamados nucleótidos unidos mediantes enlaces fosfodiester. Los nucleótidos están formados por una pentosa o azúcar de cinco carbonos, una base nitrogenada y un radical fosfato.
Existen dos tipos de ácidosnucleicos: ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico), estos tienen a lo menos dos funciones: trasmitir las características hereditarias de una generación a la siguiente y dirigir la síntesis de proteínas especificas.




OBJETIVOS


• Extracción y Purificación de ARN desde tejido muscular de trucha.




• Determinación de la concentración y la pureza del ARN aisladomediante técnicas espectrofotométricas.



• Análisis de la integridad del ARN aislado mediante electroforesis convencional.

































MAERIALES Y METODOS

Se analizo tejido muscular de trucha (Oncorhynchus mykiss), el cual fue proporcionado por las instructoras del laboratorio, contenido en un criotubo y almacenado en una cama dehielo.
Se homogenizaron 179.8 mg de tejido de Oncorhynchus mykiss, mediante la adición de 500 µL de TRIZOL y se macero con un embolo hasta obtener una mezcla homogénea.
Se procedió a incubar por 15 minutos la muestra, a temperatura ambiente. Luego se agregan 100 µL de cloroformo (DEPC), se agita para luego incubar a temperatura ambiente por 3 minutos.
Continuando se centrifuga a 12000 rpmpor 10 minutos, para luego extraer la fase acuosa superior, tratando de no tomar la interface y fase orgánica, trasfiriendo a un tubo eppendorf de 1.5 mL.
Obtenido el nuevo tubo, se adiciona 250 µL de alcohol isopropilico (DEPC), incubando a temperatura ambiente por 10 minutos. Luego se centrifugo a 12000 rpm por 10 minutos, obteniendo un pequeño pellet de color blanco. A continuación se extraeel sobrenadante y se lava el pellet con 500 µl de etanol 75% (DEPC), enseguida se agita y se centrifuga a 7500 rpm por 5 minutos. Finalizando, se seca el pellet y se resuspende en 30 µL de agua DEPC.
La Determinación de concentración y pureza de RNA se realizo mediante espectrofotometría, midiendo a 260 nm y 280 nm, una dilución 1:50 con agua nanopure. Mediante electroforesis convencional sediagnostico el ARN total, alicuotando una muestra que contiene 2µg de ARN total en 10 µL de solución para visualizarlas en el gel de agarosa. Se agregan 2 µL de buffer de carga de Geles 6X.
Posteriormente es sembrada la muestra en un gel de agarosa al 1% con EtBr (0,5 µg/mL conc. Final) y se deja correr de 4-6 Volt/cm.



CALCULOS

Cálculos reactivos

Ejemplo del cálculo realizado paraagregar cloroformo DEPC, a través de una regla de tres simple:

Por 1mL de TRIZOL agregar 200 µL cloroformo (DEPC)

Tenemos 1000 µL TRIZOL 200 µL cloroformo (DEPC)

500 µL TRIZOL X

X= 100 µL de cloroformo (DEPC)









Ejemplo del cálculo realizado para agregar alcohol isopropílico (DEPC)Por 1mL de Trizol usado agregar 0,5 mL de alcohol isopropílico (DEPC)

Tenemos 1000 µL Trizol 500 µL alcohol isopropílico (DEPC)

500 µL Trizol X

X= 250 µL de alcohol isopropílico (DEPC)



Ejemplo del cálculo realizado para agregar etanol 75%

Por 1mL de Trizol usado, agregar 1000 µL etanol 75%...