Pcr - Métodos Extracción Y Purificación De Ácidos Nucleicos

PCR

Diseño del laboratorio: zona limpia donde se hace la preamplificacion (no entran las muestras) y la zona sucia de amplificación y post amplificación. Cada una tiene sus elementos. Flujounidireccional, las cosas van de la zona limpia a la sucia. Se descontaminan antes y después de trabajar. Preparación de las muestras: métodos apropiados de muestreo, conservación y transporte. Si setrabajan con patógenos usamos equipo de bioseguridad 2.

Tipos de muestra: sangre, plasma, hisopados, células, tejidos, líquidos biológicos, médula ósea. Luego de tener la muestra, se piensa en el mejormétodo de extracción, considerando la muestra, el organismo y los ácidos nucleicos.

Inhibidores de la PCR: grupo hemo de la sang, tengo que buscar un método que me saque todos los inhibidoresnaturales. Además, nosotros también introducimos inhibidores. Hay que mantener la integridad de los AN, ser lo más eficiente posible.

Controles: positivos (valores cercanos al límite de detección deltest), negativo (todos los reactivos menos el blanco) y un control interno (para validar la presencia de AN, la ausencia de inhibidores, la manipulación de la muestra). Mimético de ARN, ARN blindado y genendógeno.

Extracción: sacar los componentes de las células. Inactivo las nucleasas, liso las células, clarifico (centrifugar).

Purificación: separas AN de los proteínas solubles, de lípidos, desales, de compuesto orgánicos, de otros AN.

Etapas: fragmentación del tejido (métodos físicos, métodos químicos, métodos enzimáticos), lisis celular (sc con EDTA, detergentes, sales, proteinasaK), clarificación, purificación (desproteinización con fenol, salting out, cromatografía de II o de absorción con silica).

Método fenólico: lisis, fase acuosa con AN. El fenol es cáustico ycorrosivo. Extracción fenol cloroformo, ppdo, lavado, secado.

Cromatografía de Intercambio Iónico: intercambio irreversible de los iones en sc que se unen a una resina de intercambio sólido. Pegado,...