Aislamento y purificación de ácidos nucleicos

Ingeniería genética molecular

AISLAMENTO Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Para aislar y purificar ácidos nucleicos es necesario seguir los siguientes procedimientos:

1. Lisis celular en procariotas y eucariotas
Hay diferentes tratamientos para conseguir la rotura de las células y liberar su contenido: 1.1. Degradación de la pared celular Bacterias

Para eliminar (o por lo menosagujerear) la pared bacteriana se utiliza una enzima llamada lisozima. Levaduras, hongos y plantas

Se utilizan enzimas proteasas (más potentes que las lisozimas) llamadas liticasas. Además, es posible realizar una rotura mecánica utilizando: o Perlas de vidrio: Al agitarse fuertemente rompen la pared celular. o Nitrógeno líquido: Con él se congelan las células y el sedimento congelado se agitaprovocando la rotura de la pared. 1.2. Degradación de la membrana celular

Pueden utilizarse diferentes métodos.  Para cultivos celulares: Aparatos que utilizan perlas de vidrio con agitación vertical y horizontal alternativa. De esta manera, se rompen simultáneamente la pared y membrana celular. Lisis osmótica: Al utilizar un medio de cultivo celular hipotónico (con menor concentración de sal queel interior celular) el agua se difunde a las células y estas acaban explotando, rompiéndose a su vez la membrana celular. Detergentes: Provocan orificios e las membranas celulares.

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 Para muestras de tejidos: Es más complicado purificar el DNA de un tejido ya que, en primer lugar es necesario romperlo. La cantidad de DNA obtenida varia mucho más que si tratamos cultivoscelulares debido a que las células se hallan compactas. Por ello, se utilizan procedimiento más agresivos como sistemas mecánicos o hidrodinámicos. También pueden aplicarse ultrasonidos.

1.3.

Centrifugación

Una vez liberado el contenido celular tras la lisis, es necesario eliminar el residuo celular formado por fragmentos de pared, membranas y células no rotas. Dicho residuo esta formado en sumayoría por contenido lipídico. Para ello, se realiza una centrifugación y, el residuo (sobretodo el más membranoso) sedimenta, quedando en el sobrenadante la parte más líquida.

2.

Purificación del DNA

Para la purificación de DNA podemos emplear 3 métodos: 2.1. Extracción fenólica

Para la purificación de ácidos nucleicos se utiliza, tradicionalmente, el fenol. Hay que tener precauciónya que es un compuesto muy volátil (manipular en una campana extractora). A. Se mezcla el extracto celular (sobrenadante obtenido en la centrifugación) con una solución de fenol (fenol:cloroformo).

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B. Se agita en un vórtex. Se hace visible una masa blanquecino-amarillenta que debe extraerse. C. Centrifugar dicha masa. Observaremos dos fases: Fase superior: Es la fase acuosa y contiene DNAy RNA, es decir, los ácidos nucleicos. Interfase: Es gruesa y blanquinosa. Formada por la coagulación de las proteínas desnaturalizadas. Fase inferior: Es la fase orgánica y contiene el fenol y los líquidos de la rotura inicial.

Así, se obtiene un volumen de DNA bastante pequeño. Además, la fase acuosa no es pura, no contiene únicamente ácidos nucleicos ya que también puede contener proteínas.D. Para provocar la precipitación de ácidos nucleicos se añade a la fase acuosa alcohol y sales. Es un procedimiento fácil y rápido. En el caso de precipitar sólo el DNA añadiremos a la fase acuosa: Alcohol: 2 volúmenes de etanol o 0,6 de isopropanol. Sales: acetato sódico al 0,3 M

Así, aparece una especie de algodón blanquinoso que deberá ser resuspendido. Siempre queda RNA que puedeeliminarse mediante RNAsas.

2.2.

Membrana de sílice

El DNA obtenido se pasa por membranas de sílice y se une a ellas bajo las siguientes condiciones: Debe encontrarse bajo la presencia de elevadas concentraciones de sales caotrópicas (agente desnaturalizante que reduce la estabilidad de las proteínas rompiendo los puentes de hidrógeno) como NaI 4M. A valores de pH < 8.

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De esta...