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CASOS PRÁCTICOS
CASO 1:
A nuestro laboratorio llega una muestra de agua procedente de un rio en el que se sospecha se produjo un vertido de sustancias químicas, algunas de ellas toxicas para animales. Nos piden que determinemos si la sustancia M438 está presente en el agua y en que concentración.
* Etapa 1ª: análisis cualitativo: determinación de las longitudes de onda de excitación yemisión.

La investigación de las propiedades de fluorescencia de un compuesto requiere, en primer lugar la obtención de los espectros de extracción y de emisión, a fin de:
a) Seleccionar las condiciones de operación para aplicaciones posteriores cuantitativas en el espectrofluorimetro
b) Conocer los máximos de excitación y de emisión, lo cual nos permitirá saber si la sustancia estápresente en la muestra al comparar esos valores con un patrón
conocido.

ESPECTRO DE EXCITACIÓN |
λ(nm) | Fluorimetría (UAF) |
300 | 21 |
310 | 30 |
320 | 48 |
330 | 67 |
340 | 75 |
350 | 38 |
360 | 18 |
ESPECTRO DE EMISIÓN |
λ(nm) | Fluorimetría (UAF) |
480 | 16 |
460 | 29 |
440 | 53 |
420 | 98 |
400 | 82 |
380 | 57 |
360 | 11 |

ESPECTRO DE EMISIÓN |λ(nm) | Fluorimetría (UAF) |
480 | 16 |
460 | 29 |
440 | 53 |
420 | 98 |
400 | 82 |
380 | 57 |
360 | 11 |









Existe un pico de absorción a 340 nm y un pico de emisión a 420 nm; por lo que para saber si la sustancia M438 está presente en esta agua tendremos que observar si sus máximosde absorción y emisión coinciden con los anteriores y, si es así, concluiremos con que la muestra de agua presenta esta sustancia.
Apuntar que se cumple el desplazamiento de Stokes, definido por la separación o diferencia entre el espectro de excitación, con mayor energía y por tanto menor longitud de onda, y el espectro de emisión, con menor energía y mayor longitud de onda.

* Etapa2ª: análisis cuantitativo
Una vez comprobada la presencia de M438 y conocidas las longitudes de onda de excitación y emisión optimas en la parte 1, se procede a la cuantificación.
Realizamos una recta patrón con concentración conocidas de M438 y medimos en el espectrofluorímetro la fluorescencia seleccionando λ de absorción a 340nm y a 420nm. Posteriormente se mide la muestra (tanto los puntos dela recta patrón como la muestra se realizan por duplicado).

Para hacer la recta patrón podemos realizar previamente la media de los dos valores de fluorescencia obtenidos para cada concentración, pero para obtener una recta mas precisa usaremos todos los valores, a los cuales se les resta previamente el valor medio del blanco (0,875), ya que así disminuye el nivel de error.
Tubos | Lecturasdel espectrofluorimetro(UAF) |
blanco 0 | 1 | 0,75 |
patrón 1- 0,4mM | 16,7 | 16,5 |
patrón 2- 0,8mM | 38,8 | 41,1 |
patrón 3- 1,6mM | 73,6 | 78,2 |
patrón 4- 3,2mM | 148,5 | 139,4 |
Muestra ¿? | 60,8 | 61,6 |

Una vez que restamos el valor medio del blanco(0,875), los resultados son:

Tubos | Lecturas del espectrofluorimetro(UAF) |
patrón 1- 0,4mM | 15,825 | 15,625 |patrón 2- 0,8mM | 37,925 | 40,225 |
patrón 3- 1,6mM | 72,725 | 77,325 |
patrón 4- 3,2mM | 147,625 | 138,525 |


| |


Media = 61,2
Media = 61,2
60,8
60,8
A partir de la ecuación de la recta, determinaremos la concentración en la que se encuentra la sustancia M438 sustituyendo los valores de fluorescencia de los picos de excitación y emisión en dicha ecuación. Posteriormente, sehace la media de ambos valores.
61,6
61,6
Muestra

Ecuación de la recta: y = 44,8x + 1,025
61,2 = 44,8x + 1,025 x = 1,343mM de M348 hay en la muestra de agua.


CASO 2:
Utilización de la técnica de espectrofluorimetría para el análisis del triptófano cerebral.
El triptófano (Trp) es un aminoácido esencial que se engloba con otros (tirosina, valina, fenilalanina, leucina e...
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