Quimico Biologo Clinico

Extracción de ADN micobacteriano

Reactivos
Lisozima (10mg/mL)
Proteinasa K (10 mg/mL)
SDS 10%
NaCl 5M
Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
CTAB-NaCl
IsopropanolEtanol 70%
Agua destilada
Agua ultra pura

Preparación de material
1.- Lavar viales con agua destilada por 1 hora.
2.- Esterilizar puntas de 10mL y 1000 mL (envolveren papel y aluminio)

Extracción de ADN
1. Rotular viales.
2. Tomar colonias del cultivo con el asa y colocarlas en recipiente con perlas de vidrio. Homogenizaren vortex.
3. Agregarle a cada recipiente 2.5 mL de agua destilada. Homogenizar en vortex.
4. Colocar 0.5 mL de la solución en cada vial (4 por cepa).
5. Hervirla solución en los viales por 30 minutos.
6. Agregar 50 mL de lisozima a cada vial.
7. Incubar a 37°C y 200 rpm (mínimo 12 horas)
8. Agregar 70 mL de SDS 10%y 10 mL de proteinasa K. Mezclar en vortex inmediatamente.
9. Incubar 65°C por 10 minutos.
10. Agregar 100 mL NaCl 5M y 100 mL de CTAB (precalentado a 65°C).Mezclar en vortex.
11. Incubar 65°C por 10 minutos.
12. Agregar 750 mL de cloroformo-alcohol isoamílico. Mezclar por inversión (15x).
13. Centrifugar 45 minutos a12000g y 4°C.
14. Transferir fase acuosa a un microtubo nuevo. (aprox. 600mL)
15. Agregar 450 mL de isopropanol al microtubo nuevo. Guardar a -20°C. (mínimo 2 horas)16. Centrifugar 45 minutos a 12000g y 4°C.
17. Decantar el sobrenadante y lavar 3 veces con etanol 70%, centrifugando cada lavado por 45 minutos a 12000g.
18.Decantar el sobrenadante y dejar secar. (mínimo 12 horas)
19. Resuspender en 50 mL de agua ultra pura, dejar reposar 1 hora a temperatura ambiente y congelar a -20°C.