regulacion de la succinato deshidrogenasa

Regulacion de succionato deshidrogenasa en Escherichia coli.
Resumen
Introducción
Succinato deshidrogenasa es la única enzima unida a membrana del ciclo del acido tricarboxilico en
Escherichia coli y, por lo tanto, puede participar en la respiración, además puede funcionar en el ciclo del
ácido tricarboxílico. Los cambios en el medio ambiente pueden consecuentemente afectar tanto laactividad
respiratoria y el funcionamiento del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
La influencia de las condiciones de crecimiento sobre la biosíntesis y la actividad de membrana
deshidrogenasas y citocromos de bacterias está bien documentada. Los estudios preliminares (RubHerrera,
1968) han sugerido que el sustrato de crecimiento de carbono era importante en el gobierno de la síntesis
de succinatodeshidrogenasa en E. coli. Este estudio presenta nuevos datos sobre los mecanismos que
controlan la biosíntesis de la succinato deshidrogenasa en esta bacteria.
Metodos
Organismo y las condiciones de crecimiento. Escherichia coli HfrH, obtenido a partir de JA de MOSS,
Universidad de California, San Diego, EE.UU., se mantuvo en agar nutritivo (Difco) y se cultivó en el medio
descrito porSypherd y Strauss (1963) con 5g de tiamina/mL y, cualquiera de los dos 1% de glucosa o 0.5%
de succinato. Este medio se conoce como 'medio sintético', porque 'medio complejo', caldo nutritivo (Difco)
al 0,4%, se añadió. Las bacterias se cultivaron a 37 "C durante 4 a 5 h, el medio que se roció con
aproximadamente 2 volúmenes de aire estéril / volumen de cultivo / min. Para las condicionesanaeróbicas,
los cultivos se roció con una mezcla de 95% de N2 + 5% porque. Densidad bacteriana se midió por medio de
un fotocolorímetro Klett usando un filtro verde y el contenido de proteína se calculó a partir de la turbidez
con una curva de calibración apropiada.
Preparación de extractos libre de bacterias y sobres bacterianos. Las bacterias se centrifugaron , se lavaron
con tampón de fosfato 0.05M, pH 7,3 , y se rompieron con un 10 kHz Sonicador Branson ( Heat Systems
Ultrasonics, Plainview , Nueva York , EE.UU. ) durante tres periodos sucesivos de 15 s cada uno. El extracto se
centrifugó a 400g durante 15 min y el sobrenadante se utiliza como extracto crudo . Sobres bacterianas se
aislaron por resuspensión de las bacterias en 0,5 ml de tampón de M - Tris - HCl 0,05 M, pH 8,3 , quecontiene
20 % de sacarosa y 2 mg de lisozima ( Sigma Chemical Co. Inc. , St. Louis, Missouri , EE.UU. ) y se congelaron
en una mezcla de C02- acetona sólida . Después de descongelar a 37 " C , el tratamiento se repitió cuatro
veces . Cinco ml de tampón de fosfato 0,05 M - contiene 10 g DNasa se añadieron ( Sigma Chemical Co.) / ml
y se mezcló rápidamente hasta que la viscosidad disminuyó . Elextracto crudo se centrifugó a 50000g durante
10 min , se eliminó el sobrenadante y el residuo se resuspendió en 1 ml de tampón fosfato y se centrifugó a
500g en un gradiente lineal de sacarosa ( 50 a 20 % ) durante 20 min . sobres bacterianas apareció como una
banda opalescente dentro del gradiente .
Determinación de la actividad respiratoria. El consumo de oxígeno se midió con un electrodo deoxígeno Clark
(Yellow Spring Instrument Co. Inc., Ohio, EE.UU.), unido a una cámara cilíndrica de metacrilato con una
capacidad de 3-2 ml.
Medición de la absorción de succinato. Las muestras (5 ml) de suspensiones bacterianas en 0,05 M de tampón
fosfato, pH 7-3, a una turbidez de 360 unidades Nett (= 1,4 mg bacterial/ml en peso seco) se incubaron con 02 ml 0.05 M-[I, 4 -14Cz] succinato(sp.act. 0,01 pCi / pmol) (Calbiochem Inc., La Jolla, California, EE.UU.). A
intervalos, I ml se retiraron y se mezclan con 0,1 ml que M-KCN (a O "C) y se filtraron a través de filtros de
membrana-(24:47 diámetro de poro, Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, EE.UU.). Las bacterias
se lavaron con 5 ml de la I M-KCN enfriado con hielo. la radiactividad de las células se midió con un...