resumen leyes

Brote respiratorio

Material y métodos:

Por la explosión respiratoria (RB) determinación nitro azul se utilizó tetrazolio (NBT) colorante (Sigma). NBT fue diluido en autoclave (PBS (1 mg / 1 ml) y se filtró a través de filtros de 0,22 micras antes de su uso.
Se obtuvo muestra de sangre venosa. Las células se mantuvieron en hielo, se lavaron una vez en medio RPMI-1640 y se sembraron encultivos de células de 2x106 en volumen de 0.-0.9 ml de medio RPMI-1640 (10% de FCS + 1% Penicilina / Estreptomicina + 1% de HEPES + 1% de L-glutamina) en placas de 24 pocillos (multiplaca pozos; 16 mm de diámetro; Los cultivos se incubaron durante la noche en un humidificado atmósfera con 5% de CO2, a 37 ° C. La infección y la estimulación se realizaron inicialmente mediante la adición de 100 l debacterias vivas y muertas con células en mismas concentraciones durante 30 minutos a 37 ° C con 5% de CO2.
Al final del período de las células se lavaron tres veces con medio RPMI-1640 (con 200 mg / ml) gentamicina) con el fin de eliminar las bacterias extracelulares Después de la etapa de lavado, mediante la adición de 100 l - 200 l y combinaciones de L-arginina (1 mM / ml, 0,4 mM / ml,respectivamente) se añadieron a los macrófagos que a continuación se mantuvieron en cultivo con medio RPMI-1640 (con 100 mg / ml de gentamicina) durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO2.

Nitro azul tetrazolio (NBT) es un colorante redox, y la reducción de NBT muestra la presencia de superóxido y radicales de oxígeno, principalmente la RB. En prueba de NBT dos métodos conocidos se modificaron (13,14).NBT fue preparado por una concentración de 1 mg / ml en PBS y se filtró a través de filtros de 0,22 micras antes de su uso. Después de nitrito de terminación, medio de cultivo se vertió y 100l de PBS-NBT mezclas fueron dispensadas para la incubación 30 minutos a 37 ° C.
Después del paso de incubación, se recogieron muestras por triplicado para la determinación de las concentraciones de nitrito.El nitrito se genera la oxidación de NO y estable en medio de cultivo al menos durante 3 días. Refleja la cantidad de NO producido.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm.
Una gama de diluciones de 2 veces de nitrito de sodio (0-100 mM) en RPMI-medio se ejecute en cada ensayo para generar una curva estándar.
Al final delas mezclas de incubación se vertió y las células con precipitaciones azules
se contaron. Formación espontánea límite se mantuvo a 50% de células por pocillo (positivos fueron superiores a 50%, negativos fueron inferiores a 50%). Los resultados fueron bien (+) o (-) en, al menos, más de la mitad de las células totales.
La respuesta NO contra la Salmonella typhimurium en vivo solo fue probadopor la prueba de los signos de los valores medios de todos los experimentos. Prueba estadística de bacterias vivas / muertas en la producción de NO se realizó mediante la prueba t pareada. ( Turk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33:200-204)


Actividad fagocitica:

Determinación de la Viabilidad celular:

En placas de cultivo de 24 wells, se coloco 500ul de las diluciones y suspensionescelulares a cada uno de los tiempos de incubación (15’ y 30’). La muerte celular se determino por la presencia de trypan blue citoplasmático, lo cual le confería una coloración azul. El número total de células y el porcentaje de células no viables fue determinado usando un hemocitometro bajo microscopia óptica. La viabilidad celular será expresada como el porcentaje del número de células vivas/número decélulas totales. Los resultados se expresaran como la media + SEM de los ensayos realizados por duplicado a cada tiempo del protocolo.

Análisis morfológico de los macrófagos

Para lograr la adhesión, se colocaron cubreobjetos en placas de cultivo de 3cm, en el que fueron distribuidos suspensiones de macrófagos 1 x 106 células , e incubadas con las distintas diluciones de formocresol por 30...