sanger

Introducción

Objetivos: Identificar el Aa alfa- terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger

Interpretación de los pasos para obtener derivadodinitrofenilado.
Para conocer la identidad y la función biológica de la Hemoglobina como aminoácido amino terminal
A 30 mg de Hemoglobina adicionamos bicarbonato de sodio para llevarlo a PH básico,desprotonando el grupo amino terminal
Añadimos 2ml DNFB al 1% agitando vigorosamente durante una hora para que no se vuelva acida nuestra solución, manteniendo un PH entre 8-9 verificándolo con un papelindicador.
Al terminar la dinitrofenilación, ajustamos el Ph debajo de 3 con HCL3N para protonar.
En el tubo extraemos 3 veces la suspensión con volúmenes iguales de éter saturado con soluciónacuosa de FESO4. Retiramos la fase etérea y conservamos la fase acuosa. Colocamos el tubo que contiene la proteína dinitrofenilada en baño maría y agitamos hasta evaporar los residuos de éter quepudieran haber quedado. Centrifugamos a 300rpm, eliminamos el sobrenadante.
Hidrolizamos la proteína para romper los enlaces peptídicos obteniendo aminoácidos libres. Resultándonos un parte etérea y unaacuosa. Los aminoácidos que no están en el extremo se quedan en fase acuosa , los aminoácidos del grupo terminal se quedan en la fase etérea , siendo estos nuestro dinitrofenil derivado. Extraemos elhidrolizado 3 veces con volúmenes iguales. Desechando la fase acuosa.
Factor de retención
DNP-Phe

RF
DNP-phe
0.57
Glutamina
0.63
Valina
0.71
DNFB
0.49
MUESTRA 2
0.63

Nuestroamino acido alfa amino terminal en la cadena de la molécula de la hemoglobina es Glutamina.
Discusión
Para asignar la estructura a los péptidos, tuvimos que saber cuántos residuos de aminoácidosconstituyen la molécula y cuantos hay de cada uno de ellos y su secuencia a lo largo de la cadena
Al hidrolizar en solución acida HCL, obtuvimos la composición y la cantidad de aminoácidos...