SANGER








Objetivos

Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger


Introducción

El método de 1-fluoro-2,4,dinitrobenceno(DNFB) para la determinación en péptidos y proteínas de los aminoácidos con el grupo alfa amino libre fue introducido por F. Sanger La determinación cosnsite en la dinitrofnilación del aminoácidoN-terminal de la proteína, la eliminación del DNFB que no reaccionó, hidrólisis de la DNP-proteína y de la identificación del residuo N-terminal por cromatografía en papel.

¿Qué hicimos?
¿Para qué?Hemolobina+Bicarbonato de Sodio+DNFB
Para que reactivo de DNFB reaccione con la proteína, se tiene que llevar a cabo en condiciones alcalinas
Agreamos HCl al 3 N
Para detener la reacción
Agregamos étersaturado con solución acusosa de FeSO4
Para obtener la fase acuosa de la solución
Colocar en la proteína dinitrofenilada en baño maria y agitar
Para eliminar cualquier residuo de la fase etérea que pudohaber quedado
Centrifugamos a 3000rpm a 15 minutos
Para eliminar el sobrenadante
Añadimos HCl al 6N
Para que la proteína se hidrolizara en condiciones ácidas.
Después se calentó en autoclave a 3 horasy 15 libras
Para que la hidrolisis se llevara a cabo se necesitaban de éstas condiciones de temperatura y presión
Agregamos éter saturado, en 3 porciones
Para obtener el hidrolizado
En papel Whatman,se realizó una cormatografía en papel
Para la identificación del residuo N-terminal de la hemoglobina
Utilizando ácido cítrico, citrato de sodio
Como solvente
Se colocó dicho cromatograma, en unacámara previamente saturada con el solvente













Se realzó el mismo procedimiento de cromatografía para DNP-phe, DNP-Asp. Dnp-Val
Para comparar los resultados obtenidos de Rf, para cada aminoácidoDespués de 5 horas, sacamos los cromatogramas de la cámara, y se marcó el frente del solvente
Para obtener los datos necesarios para realizar los cálculos de rRf
Por dicha cromatografía se...