Secuenciacion del adn

Los inicios
Durante treinta años la mayor parte de la secuenciación de ADN se llevó a cabo con el método de terminación de la cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores en 1975.[1] [2] Antes del desarrollo de métodos rápidos de secuenciación del ADN a principios de los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard,[3] [4] se utilizaban varios métodos delaboratorio. Por ejemplo, en 1973[5] Gilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como "de punto corrido" (wandering spot).

La secuenciación del ARN, que por razones técnicas es más sencilla de llevar a cabo que la del ADN, se desarrolló con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la secuenciación del ARN, que data de la era previa al ADNrecombinante, es la secuencia del primer gen completo y del genoma completo del Bacteriófago MS2, identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores de la Universidad de Gante.[6] [7]

[editar] Secuenciación de Maxam-Gilbert
En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas[8]Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciación química dos años antes del trascendental artículo de Sanger y Coulson sobre su método de secuenciación "más-menos",[9] [10] la secuenciación de Maxam y Gilbert rápidamente se hizo más popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el método inicial de Sanger requería que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADNde cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del método de terminación de la cadena (ver más adelante), la secuenciación de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad técnica, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y dificultades para escalarla. Además, a diferencia del método de terminación de la cadena, los reactivos que se usan en el método de Maxam yGilbert no se pueden adaptar para utilizrse en un kit biológico estándar.

En resumen, el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera unaserie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. Para visualizar los fragmentos generados en cada reacción, se hace una autoradiografíadel mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia.

Conocido en ocasiones como "secuenciación química", este método se originó en el estudio de las interacciones entre ADN y proteínas (huella genética), estructura de los ácidos nucleicos y modificacionesepigenéticas del ADN, y es en estos campos donde aún tiene aplicaciones importantes.

[editar] Métodos de terminación de la cadena

Parte de un gel de secuenciación con marcaje radiactivo.Mientras que el método de secuenciación química de Maxam y Gilbert y el método más-menos de Sanger y Coulson eran órdenes de magnitud más rápidos que los métodos previos, el método de terminación de la cadenadesarrollado por Sanger era incluso más eficiente y rápidamente se convirtió en el método de elección. La Técnica de Maxam-Gilbert requiere el uso de productos químicos altamente tóxicos y grandes cantidades de ADN marcado radiactivamente, mientras que el método de terminación de la cadena utiliza pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radiactividad. El principio clave del método de...