secuenciación de ADN

Índice

Introducción
La secuenciación
Obtención de ADN
Métodos de secuenciación clásicos
Secuenciación de Maxam – Gilbert
Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger
Métodos de secuenciación masivos
Pirosecuenciación
Como ensamblar secuencias
Método aleatorio
Cóntigos de clones
Utilidades
Bibliografía


Introducción

-La secuenciación

El objetivo final de unproyecto de genoma es obtener la secuencia completa del ADN del organismo estudiado, de manera que podamos localizar los genes y otras características interesantes. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la secuencia de nucleótidos del ADN.

Estos métodos son un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden y el número delos nucleótidos (A, C, G y T). El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología.

Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano y para desarrollar el genoma de animales y plantas.-Obtención de ADN

Para poder secuenciar el ADN, necesitamos grandes cantidades de este. Además necesitaremos que el ADN sea monocatenario. Se puede obtener de distintas maneras:

-Se puede clonar el ADN en un plásmido vector. El ADN será bicatenario. E convierte en monocatenario por desnaturalización con álcali o por ebullición.

-Se puede clonar el ADN en un bacteriófago M13 vector. Estos estándiseñados para producir moldes monocatenarios para la secuenciación de ADN.

-Se puede clonar con un flagémido. Es un vector de clonación que actúa como fago auxiliar.



Métodos de secuenciación clásicos

-Secuenciación de Maxam – Gilbert

Este método fue presentado antes que el método de Sanger, y durante un tiempo fue más utilizado. Tras el perfeccionamiento del método de Sanger, este métododejo de usarse de un modo global debido a su coste y peligrosidad.

El método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar.
El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones: G, A+G, C, C+T. Se corta ahí porque es complicado romper losenlaces A+T. De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente, hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante una electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro pocillos distintos. Se les hace una fotografía usando radiaciones UV, lo que proporciona unaimagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales se puede saber la secuencia de ADN.



-Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger.

El método enzimático o de Sanger es la base de las variantes más utilizadas actualmente para la secuenciación a gran escala de ADN. Aquí no se degrada el el ADN,sino que se sintetiza una hebra complementaria de manera controlada a partir de ADN polimerasas, dándole el carácter enzimático, y se marca o con isotopos radioactivos o con fluorocromos.
Para ello la polimerasa debe tener las siguientes características:
Alta procesividad. Esto es la longitud del polinucleótido sintetizado por la polimerasa.
Actividad exonucleasa 5’ -> 3’ y 3’ -> 5’ insignificanteo nula, ya que si no podría degradar los polinucleótidos sintetizados.
Como se polimerizan varias cadenas distintas, es necesario el uso de cebadores que se unen al extremo 3’ que se quiere secuenciar.
Están los cebadores universales, complementarios inmediatos de la del punto en el que se liga el ADN nuevo, los no universales, que hibridan a partir del universal ya que este no puede llegar a...