secuenciar

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en unvector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como moldeADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".
Un cebador o "primer" que suele ser unoligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de basescomplementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementariaal vector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer"utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatronucleótidos trifosfato en cada reacción.
Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupohidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto,una vez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.



Breve descripción del método enzimático de terminación de cadena

En primer lugar, deben...