Separación De Proteínas Por Cromatografía De Exclusión Molecular

LABORATORIO 1

Separación de proteínas por
cromatografía de exclusión molecular

Introducción

Para estudiar la función o las propiedades de una proteína, como por ejemplo, su secuencia, actividad o estructura, es de gran importancia obtenerla como una especie pura. Los métodos habitualmente utilizados en la purificación de proteínas se basan en alguna de las características de éstas,incluyendo su tamaño, carga, o capacidad de unión a distintos sustratos.

El conjunto de métodos que tienden a separar proteínas provenientes de un extracto es denominado fraccionamiento, entre los que destacan las cromatografías en columna. Los métodos cromatográficos habitualmente utilizados en el estudio de proteínas son las cromatografías de exclusión molecular o filtración en gel,cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y HPLC.

En el presente práctico se nos presenta como objetivo la separación de proteínas contenidas en en una mezcla, mediante cromatografía de exclusión molecular, utilizando como fase estacionaria Sephadex G75. Una de estas proteínas es la fosfatasa ácida de trigo.

Procedimiento experimental.

1. Preparación de la columna. Se montará una columna deSephadex G75.

* Coloque un pedazo de lana de vidrio en el fondo de la columna de vidrio.
* Cierre la llave de paso de la columna y llénela con agua destilada. Posteriormente, abra la llave de paso y deje escurrir el agua hasta llegar a la mitad de la columna. De esta forma evitará la formación de burbujas a la salida de la columna.
* Agregue la suspensión de Sephadex G75 y dejesedimentar. Posteriormente, abra el flujo de la columna y continúe agregando Sephadex hasta formar una columna empaquetada de 10 a 12 cms.
* Equilibre la columna haciendo pasar dos volúmenes de agua.

2. Sembrado y elución de la muestra. Se utilizarán dos muestras. La primera de ellas es una solución de Azul Dextrano, y la segundo es una mezcla compleja que contiene seroalbúmina bovina (BSA;2 mg/ml) fosfatasa ácida de germen de trigo (2 mg/ml) y Citocromo C (1 mg/ml)

* Eluya el agua de la columna hasta que la superficie del gel esté a punto de secarse
* Con una micropipeta, agregue 500 l de muestra

* Eluya muy lentamente hasta que la muestra haya ingresado completamente en el gel.
* Agregue agua a la columna.
* Comience la elución dela muestra, colectandofracciones de 1 ml en tubos Eppendorf

3. Confección del cromatograma. En papel milimetrado, se confeccionarán los perfiles de elución de proteínas obtenido.

* Mida la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas a 280 y 550 nm, usando el eluyente como blanco
* Grafique Abs vs número de fracción
* Interprete los resultados obtenidos, y guarde fracciones representativas paralos máximos. No olvide guardar también un mínimo como control negativo.

LABORATORIO 2

Determinación de la concentración de
proteínas por el método de Bradford

Introducción

Se han descrito numerosos métodos que permiten determinar la concentración de proteínas; todos ellos presentan ventajas y desventajas. La elección del método entonces dependerá de la naturaleza de la proteína, lanaturaleza de los otros componentes presentes en la muestra o la sensibilidad o rapidez deseadas.

Tradicionalmente, los métodos más usados se basan en diferentes propiedades químicas y físicas de las proteínas, siendo los principales los ensayos de Biuret, Lowry y Bradford. Este último se basa en las propiedades del colorante Azul de Coomasie G-250, capaz de unirse a las proteínas con un máximode absorción de 595 nm. La coloración es proporcional a la concentración de proteínas, obteniéndose un comportamiento lineal en el rango de 0 a 30 g de proteínas.

Anteriormente, fue determinado mediante el método de absorción UV la presencia de máximos de absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas en la separación cromatográfica. El objetivo del presente práctico será calcular la...