Separación de grupos usando cromatografía por exclusión

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Laboratorio de métodos de análisis

Separación de grupos usando cromatografía por exclusión

Separación de grupos usando cromatografía por exclusión
Objetivos
a) Determinar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico.
b) Efectuar la desalación de la albumina, utilizando la técnica decromatografía por exclusión.
Fundamento
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinadotamaño. Las moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rápidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que son excluidos del gel. De esta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño,eluyendo en orden decreciente de peso molecular.

Resultados:
Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.
Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.
Volumen de elución (mL) | A615 |
3 | 0 |
6 | 0 |
9 | 0 |
12 | 0 |
15 | 0 |
18 | 0 |
21 | 0.02 |
24 | 0.323 |
27 | 0.284 |
30 | 0.069 |
33 | 0.019 |
36 | 0.007 |
39 | 0.004 |
42 | 0.002 |
45| 0 |
48 | 0 |

Imagen 1. Perfil de elución de la dextrana azul 2000.

¿Cuál fue el Volumen total de toda la Columna?

Vt= πr2h
Vt= π x (0.85 cm)2 x 25.6cm
Vt= 58.11

¿Cuál fue el Volumen vacio V0 de la columna? ¿Qué importancia tiene determinarlo?

El volumen fue de 24 mL. Es de gran importancia ya que es el volumen al que eluyen las moléculas de mayor tamaño al intervalo defraccionamiento del gel.

Determine el Volumen interior de la estructura del gel Vi y el Volumen del gel solo Vg.

1. Se determina el volumen total

1 g ------> 5mL
x -----------> 58.11

VT= x=11.62mL

2. Se determina el volumen interior

1 g ------> 2.5mL
11.62g-----------> x

VI= X=29.05mL

3. Se determina el volumen de Vg mediante un despeje

Vt= Vi+ Vg +V0 despejando a Vg
Vg= Vt- (Vi + V0)

Vg = 58.11-(29.05+24) ml

Vg= 5.06ml

Separación del sulfato de amonio de la proteína

Tabla 2. Separación del (NH4)2SO4 y la Albúmina
volumen de elución | A280 | masa del tubo vacio (g) | masa del tubo con precipitado (g) | (NH4)2SO4 (mg) |
3 | | | | |
6 | | | | |
9 | | | | |
12 | | | | |
15 | | | | |
18 | | | ||
21 | 0.459 | | | |
24 | 0.306 | | | |
27 | 0.042 | | | |
30 | 0.006 | | | |
33 | | 8.4917 | 8.4983 | 6.6 |
36 | | 6.0636 | 6.084 | 20.4 |
39 | | 7.5402 | 7.59 | 49.8 |
42 | | 9.8531 | 9.9038 | 50.7 |
45 | | 7.4523 | 7.4701 | 17.8 |
48 | | 6.2738 | 6.278 | 4.2 |
51 | | 6.0893 | 6.0931 | 3.8 |
54 | | 7.5387 | 7.5416 | 2.9 |
57 | | | | |
60 | || | |
63 | | | | |
66 | | | | |
69 | | | | |
72 | | | | |

Nota: Los valores que no se pusieron en la tabla son cero o no son de importancia por lo que fueron omitidos.

Imagen 2. Perfil de elución de la albúmina y el sulfato de amonio.

¿Qué sustancia eluyó Primero y cual después? Explique porque.

La sustancia que eluyó primero fue la albumina, seguida delsulfato de amonio, esto se debe a que la albúmina tiene mayor peso molecular, asi como mayor tamaño que el sulfato de amonio, por lo tanto es excluida del gel y tarda menor tiempo en eluir con respecto al sulfato de amonio, mientras que el sulfato de amonio si puede entrar en el gel y por lo tanto tardará más en eluir.

¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es cromatográfica...