Separación De Proteínas Por Electroforesis En Gel De Poliacrilamida

Separación de Proteínas por Electroforesis en Gel de Poliacrilamida.
Objetivos.
* Efectuar la separación de proteínas de varias muestras mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida.
* Determinar el tamaño óptimo de poro del gel, para la mejor separación de cada una de las muestras.
Introducción.Una técnica importante para la separación de proteínas se basa en el desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico, proceso denominado electroforesis. Estos procedimientos no son utilizados por lo general para purificar proteínas en grandes cantidades, dado que usualmente existenmétodos alternativos más sencillos, y que los métodos electroforéticos frecuentemente afectan a la estructura y por tanto a la función de las proteínas. No obstante, la electroforesis es muy útil como método analítico. Su ventaja es que las proteínas pueden visualizarse además de separarse, lo que permite al investigador hacer una estimación rápida del número de proteínas en una mezcla o del grado dela pureza de una preparación proteica determinada. La electroforesis también permite la determinación de propiedades cruciales de una proteína tales como su punto isoeléctrico y su masa molecular aproximada. La electroforesis de proteínas se lleva a cabogeneralmente en geles formados por el polímero entrecruzado poliacrilamida. El gel de poliacrilamida actúa como un tamiz molecular, retrasando la migración de las proteínas en una forma aproximadamente proporcional a su cociente carga/masa. La migración también puede estar afectada por la forma de la proteína. En la electroforesis, la fuerza que mueve la macromolécula es el potencial eléctrico, E.la movilidad electroforética de la molécula µ, es el cociente entre la velocidad de la partícula, V, y el potencial eléctrico. La movilidad electroforética también es igual a la carga neta de la molécula, Z, dividida por el coeficiente friccional, f, que refleja en parte la forma de la proteína. Así:
μ=VE=Zf
El desplazamiento deuna proteína en un gel durante una electroforesis es por tanto una función de su tamaño y de su forma. Un método electroforético comúnmente utilizado para la estimación de la pureza y la masa molecular emplea el detergente dodecil sulfato sódico (SDS) (“dodecil” se refiere a una cadena de 12átomos de carbono).

El SDS se une a la mayoría de proteínas en una cantidad aproximadamente proporcional a la masa molecular de la proteína, alrededor de una molécula por cada dos residuos de aminoácidos.
El SDS ligado incorpora una gran carga neta negativa, lo que hace que la carga intrínseca de la proteína sea insignificante y confiere a todas las proteínas un cociente carga/masa similar. Además,la conformación nativa de la proteína se altera cuando se fija el SDS y la mayoría de las proteínas adoptan una forma similar. La electroforesis en presencia de SDS separa, por tanto, las proteínas casi exclusivamente en función de la masa (peso molecular), de forma que los polipéptidos pequeños se desplazan más rápidamente. Después de la electroforesis las proteínas se visualizan añadiendo uncolorante tal como el azul Coomassie que se fija a las proteínas pero no al gel. De esta forma puede seguirse el progreso de un procedimiento de purificación de una proteína, ya que el número de bandas de proteína visibles en el gel debe disminuir tras cada nuevo paso de purificación. Cuando se compara con las posiciones a las que se desplazan en el gel proteínas de masa molecular conocida, la...