simona

Por lo general estas bibliotecas se depositan en microplacas de 384 pozos, en donde podemos conocer la ubicación exacta de cada uno de los genes. (Flores et al, 2003).

MATERIALES Y MÉTODOS
El desarrollo de este trabajo se inició: A) a partir del RNA total obtenido del tubo digestivo de camarón blanco, Litopenaeus vannamei, sometido a diferentes tratamientos: (1) expuesto a Vibrio sp V22(Lv/Vibrio), (2) expuesto a Lactobacillus plantarum TD23 (Lv/LB) y (3) organismos control sin exposición a una bacteria especifica (Lv). B) a partir de secuencias de productos de PCR amplificados en el Despliegue difencial llevado a cabo por García et al, 2007. Dichas secuencias se observan en la tabla 1.
Tabla 1 Amplicones obtenidos con el DD y su tratamiento
Código del producto
*Lactobacillus*Vibrio
G1C
-



-
G2A
+
Sin cambio
G2F
+
Sin cambio
G3H
++
++
G3J
-
-
G3K
+
Sin cambio
G3L
-
-
G3M
++
++
G3N
+
Sin cambio
G3P
+
Sin cambio
G4A
+
Sin cambio
G6C
+
Sin cambio
* (+) Se indujo, (-) Se reprime, (++) Incremento en la expresión
Amplificación Rápida de los Extremos del ADNc 5’ (RACE)
Para extender las secuencias ( Expressed Sequence Tags, ESTs)obtenidas en el Despliegue Diferencial hacia el extremo 5’ y tratar de obtener los ADNc completos se recurrió a la técnica de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Para ello se empleo un kit comercial y se siguieron las instrucciones del fabricante (Clontech Laboratories Inc.) con ligeras modificaciones que se describen a continuación.
Diseño de primers gen-específicos (GSP) PARA 5´ RACE
Apartir de las secuencias de los 10 fragmentos que se obtuvieron en el despliegue diferencial, se diseñaron primers reversos específicos para cada gen.
El diseño de los primers se realizó con el software IDT OligoAnalyzer 3.0 (pagina web http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx).
Se diseñaron 2 primers reversos para cada fragmento denominándolos RevA para el primermás cercano a la región 3´ y RevB para el primer más próximo a la región 5´. Los primers se sintetizaron en la compañía SIGMA-GENOSYS. Los primers liofilizados se disolvieron con buffer TE ajustando la concentración a 1 nmol/µl para la solución stock y a 10 pmol/µl para la solución de trabajo.

Síntesis de ADNc a partir de ARN total del tubo digestivo de camarón. Se sintetizóADNc para cada tratamiento a partir del ARN total obtenido de tubos digestivos de Litopenaeus vannamei sometido a los tratamientos mencionados anteriormente: Se tomaron 3 µl (mas de 200 ng) de cada ARN total y se mezclaron con 1µl (12 µM) de 5´-RACE CDS primer y 1µl (12 µM) de SMART II oligo (Tabla 2. Clontech Laboratories Inc.). Posteriormente, la mezcla se incubó a 70° C por 2 minutos y despuésse colocó en hielo por 2 minutos. La mezcla se llevó al fondo
del tubo mediante un pulso en la microcentrífuga (Beckman). En otro micro-tubo (eppendorf) se mezclaron 2µl del buffer 5X first-strand (250 mM Tris-HCI pH 8.3, 375 mM KCI, 30 mM MgCI2), 1µl de Dithiothreitol 20 mM, 1 µl de dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 10 mM cada uno) y 1 µl de la enzima Transcriptasa Reversa (Powerscript,Clontech Laboratories Inc.). Se mezclaron los contenidos de los dos microtubos en uno solo y se dio de nuevo un pulso en la microcentrifuga. Se procedió a incubarlo a 42º C por 1.5 horas, después se le agregó 100 µl de Buffer Tricine-EDTA (10 mM Tricine-KOH, pH 8.5), 1.0 mM EDTA), se procedió a calentar la mezcla dereacción a 72º C por 7 minutos y finalmente el ADNc sintetizado se almacenó a ─20° C.Tabla 2. Primers para 5´RACE (Clontech Laboratories Inc.)
Nombre
Secuencia
5´-RACE CDS, SMART II
5’-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3’
10X Universal Primer A Mix (UPM) Long:


Short:

CtaatacgactcactatagggcAAGCAAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

5’-ctaatacgactcactatagggc-3’

Nested Universal Primer A (NUP)
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAAGAGT-3’







Calidad del ADNc
Para evaluar la...