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Rev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Versión Online ISSN 1727-9933 La técnica SSCP para detectar mutaciones puntuales

Uso de la técnica SSCP para detectar mutaciones puntuales del ADN mitocondrial humano
Use of the SSCP technique to detect point mutations on human mtDNA Alejandro Estrada-Cuzcano, José Sandoval, María L. Guevara-Fujita y RicardoFujita*
Presentado: 07/07/2005 Aceptado: 02/02/2006

Resumen
En el presente trabajo se evalúa la técnica de SSCP (polimorfismo de conformación de cadena individual de ADN) para detectar mutaciones puntuales, tanto por su sensibilidad en la detección (alrededor 80% en condiciones ideales), como por su implementación fácil y económica. Se utilizaron como controles positivos y negativos, ADN devoluntarios caracterizados previamente para las mutaciones puntuales de 5 RFLPs mitocondriales. Para la optimización de la prueba fueron ensayadas concentraciones variables del tampón TBE (1X y 0,5X) y del glicerol (10%, 5% y 0) en geles de poliacrilamida. Cuatro de los 5 RFLPs fueron detectados en las condiciones utilizadas y pueden ser usados en estudios de rutina sin usar enzimas de restricción.Además, la técnica SSCP permitió determinar mutaciones desconocidas en un segmento de 394 nucleótidos de la región hipervariable (HVI) del ADNmt. Diferencias en correspondencia a los distintos haplotipos fueron detectados e incluso permitió discernir grupos dentro del mismo subtipo. La secuenciación de dos muestras del subtipo B1 con migración diferencial en SSCP, corroboró la existencia de sietenucleótidos distintos. Palabras clave: SSCP, ADNmt (ADN mitocondrial), mutaciones puntuales, SNP (polimorfismo de un solo nucleótido).

Abstract
We evaluate the use of SSCP (single strand conformational polymorphism), a relatively easy and inexpensive technique for the detection of point mutations with a sensibility around 80% under ideal conditions. To test the technique, we used samples ofvolunteers whose DNA had been previously characterized for the presence or absence of 5 mitochondrial RFLPs. Optimization of the tests included variations in TBE (1X and 0,5X) and of glycerol concentration (10%, 5% and no glycerol) in polyacrylamide gels. Four out of five RFLPs were detected under the conditions used and could be applied routinely without using restriction enzymes. In addition, theSSCP technique allowed detection of unknown mutations in a 394 bp nucleotide segment of the hypervariable (HVI) region of mtDNA. Differences corresponding to different haplotypes were detected, helping to distinguish groups within the same subtype. Sequencing of two samples of subtype B1 with differential migration on SSCP gels, proved the existence in seven different nucleotides. Keywords: SSCP,mtDNA, point mutation, SNP.

http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/biologia/biologiaNEW.htm

Introducción La comparación del genoma de dos individuos del mismo sexo revelaría millones de mutaciones esparcidas a lo largo de todas las regiones cromosómicas. La mayoría de las mutaciones cambian una sola base de cada 500−1000, frecuentemente en segmentos no codantes y eventualmente en los codantes.Por
(*) Instituto de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina Humana, Universidad de San Martín de Porres, Alameda del Corregidor 1531, La Molina, Lima, Perú. Tel: (511) 365–2300 / 365-2574 anexo 152, fax: (511) – 365–0487. E-mail Ricardo Fujita: rfujita@amauta.rcp.net.pe
Rev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005)

esta razón la mayor parte de éstas no tiene efectos fenotípicos. Sinembargo algunas pueden provocar o estar asociadas a enfermedades. Cuando una mutación puntual está en una frecuencia mayor al 1% en la población, se le conoce como SNP (single nucleotide polymorphism−polimorfismo de un nucleótido). Con el estudio del genoma humano se ha incrementando el conocimiento del número de genes involucrados en diversas enfermedades hereditarias. Actualmente se registran...
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