Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos: pcr, rt-pcr, pcr a tiempo real

Tema 14
Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos: pcr, rt-pcr, pcr a tiempo real

Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés, es una técnica (descrita en 1986 por Kary Mullis) cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo, en teoría de una únicacopia de fragmento. Es decir, amplifica regiones del ADN, tras lo cual resulta más sencillo identificar virus y/o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres, criminales…) o hacer una investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación lo han convertido en una técnica muy utilizada.
Esta técnica se basa en la propiedad natural de lasADN polimerasas para replicar hebras de ADN. Inicialmente la técnica era bastante lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. El descubrimiento de las polimerasas de organismos extremófilos (soportan temperaturas extremas) simplificó el proceso ya que se podía pasar de un ciclo a otro sinnecesidad de realizar la reposición de las polimerasas.
Descripción de la técnica
Para que la técnica funcione se necesita:
ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar
Abundante suministro de bases de nucleótidos (A, G, C, T) dNTPs (desoxirribonucleósidos-trifosfato)
Dos cebadores o primers, que son secuencias cortas de entre 6 y 40 nucleótidos, en general entre 18 y 22, que seusan para iniciar la reacción (PCR)
ADN polimerasa, o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
Magnesio, que actúa como coenzima de la polimerasa y es fundamental para que ésta actúe.
Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
Termociclador, el aparato que va amantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choquetérmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura deunión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar
Las diferentes etapas que tienen lugar en la PCR son:
Inicialización: Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.Desnaturalización: en primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de lamisma. Otros métodos raramente usados serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Hibridación, anillamiento o unión del cebador: a continuación se producirá la hibridación, es decir, el cebador se unirá a su complementario en el ADN. Para esto es necesario que la temperatura descienda (40-68ºC), durante unos 20-40 segundos, según el caso, permitiendo así...