Técnicas De Extracción De Ácidos Nucleicos

Precipitación ADN
Precipitación ADN
Purificación ADN
Purificación ADN
Lisis celular
Lisis celular
Nataly López Fernández
ENSAYOS BIOTECNOLOGICOS
Mecánicos, químicos o enzimáticos
Mecánicos, químicos o enzimáticos
U.T.5 TECNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

2 objetivos: neutralizar cargas negativas y deshidratar la molécula
2 objetivos: neutralizar cargasnegativas y deshidratar la molécula
Fenol/cloroformo, separa proteínas y polisacáridos
Fenol/cloroformo, separa proteínas y polisacáridos
Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

Se utilizan:
Se utilizan:
Buffer extracción
Buffer extracción
Su objetivo es las separación de ácidos nucleicos de mezclas complejas cuidando su integridad. Se extraen ADN y ARN, cada una de estas moléculas tieneespecificaciones especiales a la hora de trabajar.
Fenol(desnaturalizador, suprime solubilidad proteínas, pH neutro) define 2 fases
Fenol(desnaturalizador, suprime solubilidad proteínas, pH neutro) define 2 fases

-Tampón tris(pH6-8)
-EDTA(inactiva nucleasas)
-NaCl(estabiliza, evita formación proteínas)
-SDS(detergente, desnaturaliza proteínas y membranas
-Proteinasa K(ayuda a lisisdigiriendo proteínas, trabaja a 55°C y estar fresca)
-Tampón tris(pH6-8)
-EDTA(inactiva nucleasas)
-NaCl(estabiliza, evita formación proteínas)
-SDS(detergente, desnaturaliza proteínas y membranas
-Proteinasa K(ayuda a lisis digiriendo proteínas, trabaja a 55°C y estar fresca)
Recomendaciones generales:
-Acetato de amonio (neutraliza carga (– )de ADN) y reduce poder disolvente de agua)
-Etanol oisopropanol (el ADN permanece precipitado)

-Acetato de amonio (neutraliza carga (– )de ADN) y reduce poder disolvente de agua)
-Etanol o isopropanol (el ADN permanece precipitado)

-Conservar en frio las muestras, enzimas y soluciones tampón(buffers) que tengas enzimas (así están inactivadas) a menos que se indique especifiquen otra cuestión.

Cloroformo(suprime solubilidad proteínasestabiliza fase acuosa (ADN) y fase organiza (contaminación))
Cloroformo(suprime solubilidad proteínas estabiliza fase acuosa (ADN) y fase organiza (contaminación))
-El ADN genómico puede romperse por fricción mecánica, se evitan con mezclas no muy vigorosas y con mucho cuidado.

-Evitar a todas costa la contaminación de la muestra, en el peor de los escenarios el ADN puede perderse, se evita siendoprudente.

Se añade a la solución de purificación 0,2 volúmenes de acetato de amonio 7,5M y 3 de alcohol 100%, se mezcla y se centrifuga. Incubar a -20°C por 15-30 min retirar el pallet de ADN y lavarlos para eliminar sales con etanol 75% y centrifugar, se deja secar al aire x10-30min y resuspender en agua libre nucleasas u otro buffer para ADN(tris-EDTA pH8)
Se añade a la solución depurificación 0,2 volúmenes de acetato de amonio 7,5M y 3 de alcohol 100%, se mezcla y se centrifuga. Incubar a -20°C por 15-30 min retirar el pallet de ADN y lavarlos para eliminar sales con etanol 75% y centrifugar, se deja secar al aire x10-30min y resuspender en agua libre nucleasas u otro buffer para ADN(tris-EDTA pH8)
Extracción de ADN genómico. Con fines:
Se añade alcohol isoamílico, lasproporciones son 25:24:1
Se añade alcohol isoamílico, las proporciones son 25:24:1
Tiempo y T° de incubación de 30-60 min y T° ambiente, o otras indicaciones determinadas
Tiempo y T° de incubación de 30-60 min y T° ambiente, o otras indicaciones determinadas

* Caracterización de muestras/huellas dactilares de ADN, el ADN posee características peculiares de distintos organismos que puedencompararse entre si.
* Clonación de genes.
* Agitar hasta tener una emulsión y centrifugar para separar fases, luego usar vórtex y centrifugar otra vez, se dan 2 fases bien definidas.
Agitar hasta tener una emulsión y centrifugar para separar fases, luego usar vórtex y centrifugar otra vez, se dan 2 fases bien definidas.
Diagnostico(uso biotecnológico).
* Estudiar los efectos del...