Temas 3 6

MÉTODOS DE ESTUDIO

José A. Uranga

MICROSCOPÍA

Aparatos que aumentan la imagen de un objeto
Microscopios ópticos
Microscopio óptico de campo claro:
Simples (lupas): 1 lente
Compuestos: 2 lentes

→ lente ocular
→ lentes objetivo

Oculares
Cabezal

Objetivos

Preparación

Platina

Condensador

Enfoque

Luz

Estativo

Aumentos:
Tamaño de la imagen/Tamaño del objeto
Lente objetivo x Lenteocular
Poder de resolución:
Capacidad para distinguir como diferentes 2 objetos cercanos
Poder de resolución = 1/Límite de resolución
Límite de resolución (d): Distancia mínima entre 2 objetos
necesaria para distinguirlos como separados
Depende de: longitud de onda (λ) de la luz
apertura numérica (AN) de objetivo y condensador
La lente ocular aumenta sin mejorar d

d = 0,61λ / AN

(Fórmula de Abbe)λ= 550 nm

(Luz blanca)

Apertura numérica (AN): Tamaño de haz de luz captado por el objetivo
AN = n.senα

(Índice de difracción del aire = 1)
(Índice de difracción del aceite = 1, 5)

d (con aceite de inmersión) = 240 nm
x 1000
d (ojo humano) = 0,23 mm = 230.000 nm

Microscopio de contraste de fases:
Para observar células no teñidas
Transforma diferencias de fase en la λ en diferencias deamplitud visibles

Microscopio de contraste interferencial:
Para observar células no teñidas
Un polarizador junto al condensador desdobla la luz sobre la muestra,
posteriormente ambos haces se juntan (interfieren) generando un efecto 3D

Microscopio de fluorescencia:
Para observar preparaciones tratadas con marcajes fluorescentes
Incide una λ concreta , se emite la λ no absorbida

Microscopioconfocal:
Microscopio de fluorescencia con iluminación láser centrada en un plano de
la preparación → menos “ruido” y posibilidad de reconstrucción 3D

Microscopios electrónicos
Tubo de alto vacío (→ no células vivas)
Usan electrones como fuente de iluminación
→ λ de 0,005 nm
→ d = 3 Å (0,3 nm)
(en la práctica, d = 1 nm = 0,001 µm)
Electroimanes actúan de condensador y
lentes objetivo y proyectoraAumentos de > 500.000

Microscopio electrónico de transmisión (TEM):
Los electrones atraviesan la preparación en función de la mayor/menor
densidad de la muestra → necesarias muestras ultrafinas
Son recogidos en pantalla fluorescente o película fotográfica.

Microscopio electrónico de barrido (SEM):
Los electrones son dispersados sobre la muestra sin atravesarla
No son necesarias muestras ultrafinas →imagen 3D

Preparación de muestras para m. óptica
Fijación:
Preservar la muestra.
Formaldelhido, Fijador de Bouin, Glutaraldehido…

Deshidratación:
Alcoholes de concentración creciente
Disolventes orgánicos (xileno, tolueno…)

Inclusión:
Parafina, resinas

Corte con microtomos
Secciones de 5 µm (m.o.)

Desparafinado:
Disolventes (xileno, tolueno…)
Alcoholes de concentración decrecienteTinción:
Variada dependiendo de lo deseado

Deshidratación:
Alcoholes de concentración creciente
Disolventes

Montaje:
Porta con preparación + cubreobjetos
Preservación indefinida

Muestras congeladas:
Para ensayos enzimáticos, biopsias intraoperatorias…
Congelación en N2 liquido
Corte con criostato
Fijación, tinción, montaje…

Preparación de muestras para m. electrónica

Muestras pequeñas
Fijación:Glutaraldehido

Postfijación e impregnación:
Tetróxido de osmio

Deshidratación, Inclusión y corte
Acetona, Resinas epoxi
Ultramicrotomos: secciones 80 nm.

Tinción:
Acetato de uranilo (TEM)
Recubrimiento con Au, Pt (SEM)

Criofractura:
Fractura por planos de segmentación
de muestras congeladas
Recubrimiento con C y Pt
Generación de una réplica por digestión de la muestra

TINCIÓN DE MUESTRAS ENMICROSCOPÍA ÓPTICA

Histoquímica
Gran variedad de soluciones colorantes
Mecanismo de acción no totalmente conocido:

componentes ácidos vs. básicos
estructuras/células específicas

Metacromasia vs. ortocromasia

Hematoxilina-Eosina
Hematoxilina: colorante básico
→ elementos ácidos (basófilos): azul oscuro
Eosina: colorante ácido
→ elementos básicos (eosinófilos/acidófilos): rosa

Azul de...