Tinción De Cromosomas Gigantes De Glándulas Salivales De Larvas De Drosophila Melanogaster

Practica 3

Tinción de cromosomas gigantes de glándulas salivales de larvas de Drosophila melanogaster

Introduccion
Se conocen dos tipos de cromosomas de gran tamaño, los politénicos y los plumulados, la característica es su enorme tamaño de unas 1000 veces más que los cromosomas somáticos, la longitud va desde las 1200 a 2000 μ y su diámetro entre las 4 y 5 μ.
El origen de los cromosomaspoliténicos está en la endorreplicación del ADN genómico. Las células de las glándulas salivares de Drosophila detienen las divisiones mitóticas al cabo de unas 18 horas de desarrollo larvario, aunque la replicación del ADN cromosómico y el crecimiento celular continúan, por endorreduplición, esto es, después de un período de síntesis (S) el núcleo no entra en mitosis, sino que vuelve aexperimentar otro periodo S, repitiendo este proceso numerosas veces por lo que los cromosomas duplican sus cromatidios una y otra vez. Por medición citofotométrica del ADN nuclear en glándulas salivares de las larvas de Drosophila, se estima que los cromosomas se han replicado de 8 a 9 veces a lo largo del periodo larvario. Esta replicación del ADN afecta principalmente a la eucromatina, ya que laheterocromatina no se politeniza. Las numerosas copias de cada cromosoma permanecen asociadas entre sí de manera que cada uno de los 8 cromosomas del núcleo aumentan de diámetro, estimándose que todos los cromosomas pueden tener del orden de 1.000 a 16000 fibras de ADN. Los cromosomas con múltiples fibras que resultan del proceso de endorreduplicación se denominan cromosomas politénicos. Los cromosomashomólogos tienden a asociarse entre sí, fenómeno denominado apareamiento somático. Además del apareamiento íntimo entre los cromosomas homólogos tiene lugar la fusión de los centrómeros de todos los cromosomas, dando origen al cromocentro, que será así de naturaleza heterocromática. Gracias al apareamiento y la fusión de los centrómeros cuando los núcleos se rompen y su contenido se examina almicroscopio aparecen 5 brazos muy largos y uno muy corto que parten del cromocentro. Algunas especies de Dípteros (Sciara, Chironomus, etc.) no tienen cromocentro, de manera que pares de cromosomas politénicos aparecen separados unos de otros. La yuxtaposición de las fibras cromómero a cromómero da el aspecto típico de bandas e interbandas.

Material

* Estereoscopio
* Larvas de tercerestadio de Drosophila melanogaster
* 2 jeringas para insulina
* Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH 8.0
* Solución de fijación I (3.7% formaldehido, 1% Triton X100 en PBS)
* Solución de fijación II (3.7% formaldehido, 50% ácido acético en PBS)
* Solución de orceína (2% orceína en 3 partes de ácido acético 2 partes de ácido láctico, 1 parte de agua).

Método

1. Se tomauna larva con dos pinzas de disección y mediante un solo movimiento se corta en dos el cuerpo, procurando que el corte sea en el primer tercio del cuerpo.
2. Mediante el estereoscopio, se disecta las glándulas salivales. Estas corresponden a dos estructuras alargadas refringentes, unidas por un conducto. Se apartan sobre un portaobjetos en una gota de PBS.
3. Se repite el procedimientopara obtener de 4 a 6 glándulas.
4. Se retira el PBS mediante un trozo de papel filtro o papel secante.
5. Se coloca una gota de solución de fijación I, y se incuba temperatura ambiente por 30 segundos. Se retira esta solución mediante un trozo de papel filtro.
6. Se coloca una gota de solución de fijación II, y se incuba por 15 minutos a temperatura ambiente por 4.5 minutos. Se retiraesta solución mediante un trozo de papel filtro.
7. Se coloca una gota de solución de orceína, y se incuba por 15 minutos a temperatura ambiente. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparación y se retira el excedente de colorante con un trozo de papel filtro.
8. Se presiona con el pulgar (ó con la ayuda de un lápiz) el cubreobjetos , y se desliza de arriba abajo, después se hace un...