toxicologia

inmediato, un volumen de 600L de MeCN fue agregado y el tubo fue inmediatamente cerrado y agitado por unos segundos. luego de unos 5-10 min la mezcla fue centrifugada a 10,000xg por 5 min. un volumen de 300 L de supernata fue filtrada a 10000x g por 5 min. U|n volumen de 100 L de filtrado fue mezclado con 900 L de MeCN en un inyector automático en frasco.

Calibracion
Calibrantes basados ensangre blanca donada fue usada para la construcción de curvas de calibración de de 7 puntos. Los calibrantes fueron tratados de acuerdo a el procedimiento arriba, a excepción de 100 Lde 50%MeOH fueron remplazadas por 100 L de la mezcla estandar contentiendo las drogas. Muestras con una concentracion de 1, 5, 10, 20, 30, 40 y 50 mg/L de Vigabatrin, Pregabalin y gabapentin en la muestra de sangreoriginal fue hecha por calibracion. La concentracion de baclofen en estos calibrantes fue 10 veces menor que la concentracion de las otras 3 drogas. Las curvas de calibracion fueron creadas por analisis de poso en regresion linear de el SIL-IS areas de picos normalizadas (area analitica / area IS) y fueron forzadas desde el inicio.

Condiciones de LC-MS/MS  

Todos los extraxtos de muestra fueronmantenidos entre 72°C hasta el momento de analisis. Un volumen de 10 L fue inyectada dentro de columna amida Acquity UPLC BEH junto a un 15% de fase A movil y 85% de de fase B mobil. LA fase mobil fue cambiada por medio de un gradiente linear a un 30% de A durante 3 minutos. Luego la fase movil fue cambiada a 70% de A durante 0.1 min. 5 minutos despues de la inyeccion, el gradiente fue retornadoa 15% de A durante 0.1 min y la columna fue equilibrada por 2.9 minutos antes de la proxima inyeccion, resultando un total de tiempo transcurrido de 8 min. El eluente fue esparcido hasta los residuos durante los intervalos de 0-1.4 y 3.3-8 min luego de la inyeccion usando un interruptor de postcolumna. La taza de flujo de la columna fue 400 L/min y la temperatura de la columna fue mantenida en 301°C la temperatura de fuente y la desolvacion fueron establecidas a 150°C y 600°C respectivamente, y los flujos de cono y desolvación de gas fueron establecidos a 50 y 800 L/h, respectivamente. El espectrómetro en masa fue operado en modo ion positivo con un voltaje capilar de 3 V. El tiempo de permanencia fue de 20 ms por todas las transiciones de ion. La reacción seleccionada de monitoreo fueaplicada bajo condiciones mostradas en la Tabla I. El argon fue usado para la disociación inducida de colisión. La adquisición de los datos y el proceso fueron realizados usando MAssLynx4.1 (Waters)

Validacion del Metodo    

Precisión y veracidad
La desviación estándar de repetibilidad (SDr) (por ejemplo, la variabilidad de los resultados analitidcos independientes obtenidos por el mismooperador usando el mismo aparato y bajo las mismas condiciones en la misma muestra de prueba en un intervalo corto de tiempo) y la desviación estándar de reproductibidad en laboratorio (SDR,intra-lab) (por ejemplo, la variedad de los resultados analiticos independientes obtenidos en el mismo muestra de prueba en el mismo laboratorio por operadores diferentes en diferentes días) fueron determinados enblanco en muestras de sangre entera ante y post muerte ajustadas con vigabatrin, pregabalin y gabapentin a concentraciones de 0.02-0.04, 1, 10 y 40 mg/L y ajustadas con baclofen  a concentraciones de 0.02, 0.1,1 y 4 mg/L. Analisis duplicados fueron realizados en 8 diferentes dias. La repetitividad y los parametros de reproductibidad en laboratorio fueron calculados de acuerdo a los estandares ISO5725-2 (33). LA veracidad del metodo (por ejemplo, la cercanía de los acuerdos entre el valor promedio de unas series largas de resultados de pruebas y de valores de referencia aceptables) fueron determinados de los resultados obtenidos en las muestras ajustadas en un estudio de precicion. La veracidad fue expresada como las tendencias relativas; tendencias relativas=(resultados de pruebas...