Tp Nº 2 - Detección De Oligodendrocitos Mediante Ihq

Detección de Oligodendrocitos en tejido cerebral de rata mediante técnicas de Inmunohistoquímica
Daniela Rojo1 & German J. Duaip1
(1) Facultad de Ingeniería y Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Favaloro danurojo@hotmail.com, german_duaip@hotmail.com
RESUMEN: en el siguiente trabajo se determino la presencia de oligodendrocitos en tejidos cerebrales de rata, mediante un análisiscualitativo con técnicas inmunohistoquímicas. Los tejidos analizados fueron obtenidos luego de ser preservados empleando técnicas de crío preservación o fijación en formol y post inclusión en parafina, aplicado un protocolo histológico de rutina para cada técnica en particular. Para la detección del antígeno se eligieron crío cortes y se realizaron incubaciones seriadas con anticuerpos primariosfabricados en conejo (anti - MBP). La marcación con peroxidasa se efectuó en un anticuerpo secundario anti – conejo y post revelación y amplificación con tetrahidrocloruro 3,3´- diaminobencidina (DAB) y sales de níquel. PALABRAS CLAVES: oligodendrocito, inmunohistoquímica, antígeno-anticuerpo, diaminobenzidina.

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INTRODUCCION

La mielina es fabricada por células especiales, llamadas célulasgliales. Las células de Schwann mielinizan los axones de los nervios periféricos y los oligodendrocitos lo hacen en el sistema nervioso central (SNC) [1] (figura 1). Un oligodendrocito mieliniza 50 segmentos de axón en el SNC. La importancia de la mielinización se demuestra mediante la desmielinización producida en la esclerosis múltiple, enfermedad en la que el sistema nervioso (SN) destruye las vainasde mielina de algunas regiones del SNC. La identificación de los oligodendrocitos se realizó a través de técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) en las cuales el paratope del anticuerpo primario (anti-MBP: anti-Myelin Basic Protein) reconoce el epitope del antígeno (MBP). MBP media la adhesión de la superficie citoplasmáticas con las capas individuales de mielina compacta, mediante uniones de residuosbásicos con grupos cargados negativamente de lípidos de membrana de fosfatidilinositol-4,5bifosfato (PI(4,5)P2). MBP es la única proteína de la mielina que fue demostrada ser esencial para la formación de mielina, con una abundancia relativa entre un 2235%. [2] 1 Laboratorio y trabajo de campo III – Química Analítica

Figura 1. Electromicrografía de una sección de nervio de una pata de ratajoven. Se observan 2 células de Schawn, la inferior comenzando a mielinizar el axón y la superior ya definida con la vaina de mielina madura.

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MATERIALES Y METODOS

Se obtuvieron 12 muestras de cerebros de rata preservadas mediante 2 técnicas: 6 muestras con fijación en formaldehído 10% con inclusión en parafina y cortes mediante micrótomo y 6 muestras con crió preservación y corte medianteun criótomo en frío.

2.5 PROTOCOLO DE BLOQUEO DE PEROXIDASA ENDOGENA Y SITIOS INESPECIFICOS Con el fin de no obtener falsos positivos debido a uniones del anticuerpo en sitios inespecíficos (epitopes indeseados) y post revelado con DAB por interacción con la peroxidasa endógena del tejido, se realizaron 2 bloqueos con 3 lavajes de 50 μl luego de cada paso empleando PBS 1X, en el siguienteorden: bloqueo de peroxidasas con H2O2 3% (10 vol.) durante 20 min., bloqueo de sitios inespecíficos empleando un cóctel de Suero fetal bovino (SFB) 5%, Tritón-X100 1X, PBS 1X, 20 min. Ambos bloqueos se realizaron sobre una placa térmica a 37°C dentro de una cámara húmeda para favorecer las interacciones y evitar la sequedad de las muestras.

2.1 PROTOCOLO MUESTRAS EN PARAFINA

2.2DESPARAFINIZACION Las 6 muestras en parafina se incubaron con H2O destilada dentro de un Backer colocados en un Termo cell dry bath a 60°C durante 10 min. Posteriormente se realizaron 5 inmersiones seriadas de 5 min. cada una, en un Backer en el siguiente orden: 2 en Xilol, 1 en etanol 100%, 1 en etanol 70% y la última en H2O destilada. La siguiente inmersión se efectuó en H2O2 al 3% (10 vol.) sobre una placa...