TP1 Extraccion ADN Vegetal

Universidad Nacional de Mar del Plata
Facultad de Ciencias Agrarias
INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA

Trabajo Práctico Nº1: Extracción y purificación
de ADN de tejidos vegetales
I- Introducción
La mayoría de las técnicas de biología molecular que se aplican en plantas,
involucran como pasos esenciales la extracción, la purificación y el análisis de ADN.
Si el objeto del análisis es: i) los genesnucleares que no tienen genes relacionados
(de secuencias similares) en las organelas; ii) los genes exclusivos de organelas,
puede extraerse el ADN total (también llamado genómico). De lo contrario será
necesario aislar primero núcleos, cloroplastos y/o mitocondrias, y recién después
extraer el ADN de la fracción correspondiente.
A) Extracción y purificación del ADN.
Los métodos de extracción deADN pueden clasificarse de diversas maneras,
según:
a) Tipo de ADN a extraer: genómico, cloroplástico, mitocondrial.
b) Cantidad de material inicial: mini-prep (0,01-0,2 gr de material fresco (MF)), midiprep (0,3-2 gr MF) y maxi-prep (5-20 gr de MF).
c) Tipo de detergente utilizado en el buffer de extracción: bromuro de cetilmetil
amonio (CTAB), dodecil sulfato de sodio (SDS), etc.
El aislamientoy la extracción implican:
1. Ruptura mecánica de las células y suspensión de los núcleos en un buffer
estabilizante. Si el ADN a extraer es de origen procariota, se utiliza
previamente lisozima para lisar la pared celular.
2. Acción de agentes que producen la lisis de membranas, separan el ADN de los
otros componentes celulares (proteínas, carbohidratos, membranas y paredes
celulares), y loliberan en la solución.
3. Purificación del ADN mediante precipitaciones y resuspensiones sucesivas y
concentración.

1. Es una etapa crítica, porque el rendimiento final puede verse reducido si no se
rompen bien las células, o si no se protege el ADN durante el proceso.
Para romper el tejido y suspender los núcleos en la solución se utilizan métodos
mecánicos. Generalmente se efectúa una homogenización(con mortero, taladro,
torno, o vórtex) que tiene por objeto romper el tejido y molerlo a un grado muy fino.
Es muy importante en esta fase proteger al ADN de la acción de las nucleasas
endógenas (que normalmente se encuentran fuera del núcleo, pero que pueden


NOTA: las abreviaturas corresponden a los nombres de los compuestos en inglés,
normalmente utilizados en los laboratorios.

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entraren contacto con el ADN durante la ruptura de las células), y evitar la oxidación
de polifenoles, ya que sus productos desestabilizan al ADN. Para ello se trabaja de
diferentes maneras:
- Molienda del tejido previamente congelado en freezer (-20 ºC) o nitrógeno líquido
(< -70 ºC). Una vez que está bien molido, y antes que se descongele se agrega el
buffer de extracción.
- Liofilización del tejido(deshidratación en vacío). Puede mantenerse a temperatura
ambiente indefinidamente hasta efectuar la extracción.
- Efectuar directamente la molienda del tejido fresco sumergido en el buffer de
extracción.
La cantidad y la calidad del ADN obtenido al final del proceso son
directamente proporcionales al grado de ruptura del tejido tratado y al nivel de
protección logrado.
2. En esta etapa debelograrse que el ADN se disocie completamente de las
proteínas y otros contaminantes que pueden coextraerse y por lo tanto interferir con
los análisis subsiguientes. También debe evitarse perder una cantidad significativa de
ADN junto con los restos celulares.
En general se usan soluciones buffers de extracción que contienen diversos
agentes químicos:
- detergentes fuertes, que disocian las proteínas delADN y actúan
simultáneamente como inhibidores de las nucleasas endógenas que podrían
degradarlo. Los más comunes son el SDS y el CTAB.
- ácido etilendiamintetraacético (EDTA) o alguna de sus sales, que actúan
como quelantes del Mg 2+. Este ión puede producir la agregación de los ácidos
nucleicos entre sí, o con proteínas, por lo tanto al ser secuestrado por el EDTA, el
ADN se mantiene en...