tp6 ibmc


Trabajo Práctico 6
Inducción Enzimática

Objetivos:
En este TP se estudiaran las condiciones de inducción del operón lactosa. Se intentara reconstruir en base a los resultados que se obtengan de los experimentos el mecanismo de regulación del operón por control negativo y positivo.

Metodología:
El experimento consta de dos partes principales:
I. Incubación de las bacterias consoluciones inductoras o no inductoras del operón:
En esta parte se ensayarán diferentes compuestos que se supone pueden regular la expresión del operón lac. Estos compuestos actuarán sobre las bacterias vivas, produciendo cambios que luego serán visualizados en la segunda parte. Al final de esta primera parte se lisan las bacterias con SDS y cloroformo, dando por terminada la parte in vivo delexperimento.
1. Cada grupo recibirá 1 ml de cultivo de una cepa de E.Coli.
2. Preparar un baño termoestatizado a 37°C.
3. Tomar 8 tubos Eppendorf y rotularlos con número de tubo y nombre de grupo.
4. Colocar los tubos en una gradilla.
5. Seguir el siguiente protocolo (utilizar micropipetas):



Tubo N°
1
2
3
4
5
6
7
8
Cultivo
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
-
0.1
Sol. Fisiológica0.5
0.4
0.4
0.4
0.4
0.3
0.5
0.5
IPTG (40 mM)
-
0.1
-
-
-
-
-
-
Lactosa (5%)
-
-
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
-
Cloranfenicol (30 mg/ml)
-
-
-
-
0.01
-
-
-
Glucosa (10%)
-
-
-
-
-
0.1
-
-

Todos los volúmenes están especificados en ml.

6. Tapar los tubos y mezclar por inversión 3 ó 4 veces.
7. Colocar los tubos en el baño de 37°C durante 30 minutos,agitando periódicamente.
8. Agregar a todos los tubos 0.6 ml de buffer Z pH 7.
9. Agregar a todos los tubos, con excepción del tubo 4, 1 gota de SDS 0.1% y 4 gotas de Cl3CH.
10. Agitar vigorosamente los tubos durante unos 10 segundos. Luego, agregar 0.1 ml de lactosa al tubo 8.
II. Comprobación de inducción o no inducción del operón en cada caso a través de un ensayo de actividad de β-gal:
Enesta parte lo único que se hace es revelar la actividad enzimática de la enzima ya presente. Esto es una forma indirecta de revelar la cantidad de proteína sintetizada en la primera parte, bajo el supuesto de que toda la enzima sintetizada es igualmente activa. El ensayo utilizado se basa en la aparición de un producto coloreado que resulta de la degradación de un sustrato sintético (ONPG).
1.Preparar un baño termoestatizado a 28°C.
2. Limpiar, enjuagar y secar 8 tubos de ensayo.
3. Rotularlos con número de tubo y nombre de grupo.
4. Colocar los tubos de ensayo vacíos en el baño de 28°C durante 3 minutos.
5. Cuidadosamente, trasvasar el contenido de los tubos Eppendorf a los tubos de ensayo correspondientes.
6. Agregar a todos los tubos 0.25 ml de ONPG (4 mg/ml en buffer Z) yagitar.
El ONPG (orto-nitrofenilgalactosa) es hidrolizado por la enzima β-galactosidasa. El orto-nitrofenol, uno de los productos de la hidrólisis, es de color amarillo.

7. Colocar los tubos a 28°C durante 15 minutos.
8. Retirar los tubos del baño y agregar 0.5 ml de Na2CO3 5%.
9. Observar la intensidad del color desarrollado en cada tubo.
10. Ordenar los tubos según su intensidad decolor, en forma creciente.
11. Otorgar valores numéricos relativos para la intensidad de color a cada tubo.
12. Transcribir los datos normalizados a la tabla propuesta por el docente.
13. Construir un histograma de barras.


Resultados:
Tubo 1: En este tuvo no se obtuvo color apreciable- Esto se debe a que esta reprimido el operón (está pegado el represor) y por lo tanto no se produceβ-Gal. Puede ser que haya una actividad basal pero es imposible detectarla mediante este método colorimétrico. Este tubo es nuestro control negativo que nos sirve para poder comparar con los demás tubos. No hay lactosa.
Tubo 2 y 3: En estos tubos se obtuvo color, por lo tanto hay actividad de la β-Gal. La mayor coloración en el tubo 2 se debe a que el IPTG es más afín por la proteína represora...