TP6 IBMC


Introducción a la Biología Molecular y Celular.




Trabajo Práctico N 6 Inducción Enzimática.




Grupo N 6




Jonás Pinzón Osorio
Agustin Franco

























Informe Trabajo Práctico N 6: Inducción Enzimática.


Introducción


El operón lac es fundamental para el transporte y metabolismo de la lactosa en Escherichia Coli. En la experiencia de Laboratorio se estudiaron losmecanismos que regulan la expresión génica para el metabolismo de la lactosa. El sistema regulador del metabolismo de la lactosa consiste en un grupo de tres genes: Lac Y, LacZ y Lac A codificando para las enzimas galactósido.permeasa, B-galactosidasa y tiogalactósio-transacetilasa. Dentro del mecanismo de control existe una proteína que actúa como represor uniéndose al operador. El represor tiene unsitio de unión para un inductor. En presencia del complejo represor-inductor no hay afinidad por el DNA y este está ausente en el operador dejando espacio para que la RNA pol se una. La represión no es absoluta, es decir, el represor puede despegarse del operador sin el inductor y esto hace que algunas moléculas de los mRNA puedan ser transcriptas, lo que se conoce como síntesis de escape. Por otrolado, existe la proteína llamada CRP activador que tiene dos sitios de unión: uno a un ligando y otro a al DNA. Cuando esta se une al promotor le da más afinidad a la RNA pol, es decir, favorece la transcripción de los genes. El ligando que se puede unir a CRP es el AMP cíclico, y cuando están unidos es muy afín a la RNA pol.


Objetivos


Analizar e interpretar los mecanismos de inducción deloperón lac en base a controles negativos y positivos. En la primera parte el objetivo es incubar bacterias con soluciones inductoras o no inductoras del operón. Y en la segunda parte se corrobora la inducción del operón basándose en un ensayo de actividad de B-gal.


Procedimiento:


Se siguieron los pasos tal y como se citan en la guía de trabajos prácticos N 6 Inducción enzimática.


Resultados:Número de Tubo
N Grupo
1
2
3
4
5
6
7
8
1
0
5
4.7
0
0
1
0
0
2
0.5
5
4.5
0.5
0
3
0
0
3
0
5
4
1
2
3
0
0
4
-
-
-
-
-
-

-
5
0.5
4.5
5
0
0.5
3
0
0.5
6
0
5
5
0
0
2
0
0
7
0
5
5
0
0
3
5
0
8
0
5
5
0
0
3
0
0
9
0.5
5
5
0
0
1
0
0
10
0
3
2
0.5
0.5
1
0
0
Prom
0.17
4.7
4.4
0.23
0.33
2.2
0.5
0.05

Tabla 1. Resultados de producción de B-Gal en nueve grupos. La escala de 0 a 5 muestra la intensidad de coloramarillo. 0 mostrando intensidad nula y 5 mostrando intensidad máxima.

En la primera parte del tp in vivo se indujo el operón lactosa con soluciones que eran inductoras o no inductoras y en la segunda parte se reveló la cantidad de enzima previamente sintetizada que en este tp fue destinado a medir la cantidad de B-Gal sintetizada. En el tubo unono hay lactosa y hay un mecanismo de regulación negativa mediado por el represor, es decir, el represor está unido al operador. Por lo tanto no hay transcripción del gen. En este tubo nos encontramos con una situación donde hay ausencia de Glucosa y Lactosa. Sin embargo, en el gráfico 1 se puede observar una síntesis de 0.17 que se puede atribuir a la síntesis de escape. En el tubo 2 tenemoscultivo, sc. fisiológica, e IPTG. El IPTG juega un rol de inductor uniéndose al represor cambiandole la conformación y así evitando que el represor se una al operador, sin embargo el IPTG no es sustrato de la B-galactosidasa. En el gráfico 1 podemos ver una síntesis de B-gal importante y estaríamos frente a una situación donde no hay Lactosa pero hay un inductor en el sistema. No hay represor unido aloperador, hay control positivo por CRP, RNA polimerasa unida al promotor y por lo tanto una transcripción de B-Gal. El tubo 3 tiene cultivo, sc. Fisiológica, lactosa 5% y de nuevo estamos frente a una situación donde todo el sistema está inducido. La diferencia entre el tubo 2 y el tubo 3 está dada por la concentración, es decir que aun habiendo puesto más lactosa en el tubo 3 la síntesis de...