ureasa

QUíMICA BIOLÓGICA 2011
TRABAJO PRÁCTICO 3 y 4

ENZIMOLOGÍA
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA ENZIMA UREASA
Objetivo: Efectuar estudios cinéticos de la enzima ureasa presente en un extracto crudo
obtenido a partir de harina de soja (Glycine max).
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Medida de actividad enzimática:
Exceptuando unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas
espectroscópicasdirectas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la
reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la
reacción. Además, la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad
en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia
para la investigación y análisis de proteínas.
La figura 1muestra una curva típica de formación de un producto (P) en función del tiempo
para una reacción catalizada enzimáticamente. Se observa que la velocidad disminuye con el
tiempo, hecho que puede deberse a las siguientes causas:
 Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima
 El transcurso de la reacción produce una disminución significativa de la concentración
de sustrato (S)
 Lareacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al
aumentar la concentración de P

Figura 1

La medida adecuada de la actividad de
una enzima requiere que se determine la
velocidad inicial, esto es, obtener la tangente
al origen del gráfico mostrado en la figura 1.
De esta manera, las diferentes causas que
producen la disminución de la actividad con el
tiempo soneliminadas.

8

P

6

4

2

0
0

2

4

6

8

10

Tiempo

Química Biológica – Trabajo Práctico Enzimología – Año 2011

Figura 2

La figura 2 ejemplifica medidas
experimentales de la formación de P
en función del tiempo (como en la
fig.1),
determinadas
a
tres
concentraciones diferentes de S.
Puede observarse que la velocidad (v)
que se obtendría en cada casodependería del intervalo de tiempo que
se tomara para medirla.

1

s3

P

s2

s1

En este ejemplo, si medimos v para
cuando S=S1, obtendríamos el mismo
Tiempo
valor, independientemente de haber
elegido el intervalo 0-1 o el 1-2. En
cambio para S=S2, la v obtenida sería
distinta según el intervalo elegido. Para estos dos casos, la v podría calcularse
adecuadamente eligiendo elintervalo 0-1, donde la formación de P es función lineal con el
tiempo. Para el ejemplo de la figura 2, la medida de v, cuando S=S3, usando el intervalo 0-1,
no es enteramente confiable ya que se necesitan más puntos experimentales que verifiquen
la condición de linealidad en la estimación de v realizada.
Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo, hay que tener en cuentaque la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la fuerza
iónica, el pH, la concentración de S, la cantidad de enzima en el medio de medida. Todos
estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de
actividad enzimática.
La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la
aparición de un P de lareacción en función del tiempo. La determinación cuantitativa de S o
de P puede hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos
(los más comunes), volumétricos, potenciométricos, radioquímicos, espectrofluorométricos.
Independientemente del método utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una
P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros
reacciónenzimática: Sa + Sb
componentes de la mezcla de reacción. En este caso, la reacción enzimática podría seguirse
continuamente en función del tiempo. En consecuencia, podrían obtenerse numerosos
puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la
producción de Q en función del tiempo, a partir de un único medio de reacción. Esto es lo
que se denomina método...