Western Blot

WESTERN BLOT

Introducción

Técnica analítica para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular).
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: PM, estructura, hidrofobicidad
Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF )para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.
Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos.
De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.

Western blot fue desarrollado en el laboratorio de GeorgeStark, en la Universidad de Stanford. El nombre le fue dado por W. Neal Burnette. La aparición del Western fue posible hasta la aparición de las membranas.

Transferencia

Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o poracción de un campo eléctrico (electrotransferencia). En esta práctica se realizó mediante la electrotransferencia o electroblotting. Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica.

Electrotransferencia

Este método se basa en una corriente eléctrica y un Buffer de transferencia para llevar las proteínas desde el gelhacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo):
Esponja, Papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, papeles de filtro empapados y otra esponja (sandwich) se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados.Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.

La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separación entre electrodos), que suele corresponder a 0,3 a 2 Ampere de 1 a 4 horas. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamaño de la proteína. El grosor del gel es un factor que influye notablemente en la transferencia, siendo muyineficiente a partir de geles de 2 mm de espesor, y tanto más eficiente cuanto más fino es el gel, con un límite mínimo de 0,4 mm, debido a los problemas de manipulación. Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que habitualmente es donde se ha cargado el marcador de PM que al transferirlo se tiñe sobre la membrana para ver si la transferencia de toda lagama de PMs ha sido correcta.

Trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas dentro del gel.

Las membranas pueden incubarse fácilmente con anticuerpos para la detección de proteínas específicas. Son más rápidas de teñir y desteñir. Se detectan cantidades menores de proteínas, ya que se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesordel gel. Las membranas son mucho más fáciles de manipular que el gel.
Las membranas de PVDF (fluoruro de polivilideno) tienen gran capacidad de unión a proteínas y gran resistencia mecánica y en general son las más utilizadas actualmente. En general las membranas son hidrofóbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas.

Bloqueo

Para prevenirla unión no específica del sistema de detección a la membrana. El paso de bloqueo evita que los anticuerpos y otras proteínas involucradas en la detección se peguen inespecíficamente a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado background o falsos positivos. El bloqueo implica la saturación del sistema con proteínas no específicas. En el bloqueo se incuba la membrana con una...