Procedimiento de western blot

Procedimiento de western blot
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. Aveces se añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestión por las enzimas celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.[8]
Transferencia:
En las membranasde PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas atampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también más frágiles, tienden a tornarsequebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas.
Electrotransferencia
Este método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar lasproteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo): esponja, varios papeles de filtro empapados enbuffer de transferencia, gel, membrana, más papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica unacorriente eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.
Método en dospasos:
Los dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.
Método en un paso
Históricamente la detección se ha realizado en dospasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se...