Metodo Western Blot

Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

WESTERN BLOT

Alumnos: Arias Orozco Patricia E. Rosario Amaris Guevara García Jessica Wendolyn García Pérez Acosta Dent Andrea Ortiz Robles Cintia Moreno Rodríguez Eduardo Grupo: 4BM3 Asignatura: Laboratorio de Biotecnología Molecular Profesora: Dra. Paola Berenice Zarate Segura.

Práctica Western BlotLaboratorio de Biotecnología Molecular

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PRÁCTICA NO. 11 Western Blot 1. OBJETIVOS: 1.1 Objetivo General  Conocerá y realizará la técnica de western blot para detección de proteína mediante la reacción antígeno-anticuerpo. 1.2 Objetivos específicos    Conocer la metodología para realizarelectroforesis en gel de poliacrilamida. Aprender la metodología para realizar una transferencia a membrana de nitrocelulosa. Aplicar la técnica de western blot para detectar proteínas (IgG humana). 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Fundamento Western Blot El western blot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas basada en la capacidad de unión a anticuerpos específicos. Luego de separarlas proteínas en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), las bandas de proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa (electrotransferencia), las bandas individuales de proteína (proteína de interés) se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a enzimas específicas para la proteína de interés. Los complejos Ag-AB quese forman en la banda que contiene la proteína reconocida por el anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radioactivo se unió a la proteína de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot) exponiendo una placa de rayos x a la membrana, un procedimiento que se conoce como autorradiografía. Sin embargo, en los procedimientos de detección que más se usansuelen emplearse anticuerpos unidos a enzima. Tras la unión del conjugado de enzima y anticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno que produce un producto de color intenso y soluble origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno blanco. La técnica también puede identificar un anticuerpo específico en una mezcla. En este caso los antígenos conocidos de peso molecular biendefinido se separan mediante SDS-PAGE y se transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antígenos conocidos se prueban luego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo específico para uno o más antígenos. La reacción de un anticuerpo con una banda se detecta mediante el empleo de un anticuerpo secundario radio marcado o ligado a enzima específica para la especia de los anticuerposen la muestra de estudio (figura 1.).

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Figura 1. Mecanismo de acción molecular western blot

2.2 Purificación de proteína Se debe tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en solución acuosa de bajasalinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución, incorporando lentamente sulfato de amonio, (entre 20-95% de saturación), la proteína comienza a tener intercambios iónicos con los iones de amonio y sulfato, sustituye los sitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la proteína disminuye su solubilidad y “precipita”. Por lo general las moléculas demayor peso molecular se precipitan primero. Esta nueva solución se centrifuga y el precipitado que contiene las proteínas se recupera. El éxito de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la concentración de la solución.

2.3 Diálisis Consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor...