b-fructosidasa

Informe Nº1 Laboratorio



Espectrometría





























  Fecha: Jueves 20 de marzo
          Nombre Profesora: María Estela Andrés
      Nombre Ayudante: Marcela Gonzalez
Nombres integrantes: Valentina Achondo
           Tamara Akentjew
    Teresa Alarcón
    Munir Rumie










1. Introducción


Laespectrofotometría es un método físico que permite determinar la presencia de un compuesto químico en solución debido a su comportamiento de absorción de luz natural o ultravioleta.
Esto se produce ya que la energía contenida en un haz de luz excita electrones π y electrones no enlazantes. El fenómeno anterior se conoce comúnmente como absorción de la luz y permite determinar la presencia de diferentescompuestos en función de la longitud de onda que absorben, siendo los compuestos con mayor cantidad de electrones π los que absorben luz de mayor longitud de onda y menor frecuencia.
Para realizar esta medición se han definido los conceptos de transmitancia y absorbancia. La transmitancia relaciona la intensidad de luz que incide con la muestra y la que atraviesa o se transmite, donde una muestracompletamente transparente tiene una transmitancia de 100% y una opaca tiene un valor de 0.
La absorbancia se define como el logaritmo del reciproco de la transmitancia y esta se relaciona con la concentración de la sustancia que absorbe mediante la ley de Lambert- Beer. También se relaciona con el coeficiente de absorción molar, el cual depende de cada sustancia a una longitud de onda enparticular.

Las aplicaciones de esta metodología son:
-Determinación de la concentración de una sustancia en solución.
-Determinación de estructuras moleculares
-Identificación de unidades estructurales especificas.
-Medición de constantes de reacciones bioquímicas.

Es interesante notar que la espectrofotometría es uno de los mejores métodos para medir las constantes cinéticas de las reaccionesbioquímicas. Esto porque en un principio se mide la absorbancia de un compuesto a cierta longitud de onda y luego se comienza a monitorear a esa misma longitud de onda como el compuesto empieza a degradar, ya que la absorbancia y por lo tanto la concentración comienzan a cambiar. Este método es ampliamente utilizado para medir reacciones y procesos controlados por enzimas.

En la experiencia delaboratorio se utilizó anilina azul, un colorante orgánico conjugado proveniente del benceno. Tiene un peso molar de 737.72 g/mol y su estructura se representa en la figura 1.

Figura 1: Anilina Azul





2. Materiales y métodos




3. Resultados
Para el estudio de la espectrofotometría se utilizó el colorante Anilina azul en una concentración de 1 mg/100 mL. Se utilizó como blancopara la calibración agua destilada.
Como se mencionó previamente se buscará el espectro de absorción de este colorante, para esto se determina la absorbancia desde 400 nm hasta 700 nm en intervalos de 20 nm. Los resultados de esta primera revisión se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1. Medición de absorbancia entre 400 y 700 nm para el colorante Anilina azul.
𝛌 (nm)
Absorbancia
400
-0,004420
-0,008
440
-0,009
460
-0,003
480
0,003
500
0,010
520
0,017
540
0,024
560
0,031
580
0,032
600
0,027
620
0,019
640
0,008
660
0,001
680
-0,003
700
-0,005

De esta tabla se puede apreciar que el valor máximo de absorbancia es de 0,032 y ocurre a los 580 nm. Tomando este valor de 𝛌 se mide la absorbancia alrededor con intervalos de 5 nm entre 555 y 605, para obtener conmayor exactitud la absorbancia máxima. Finalmente se identifica el nuevo 𝛌 para la absorbancia máxima y se mide nuevamente con intervalos de 1 nm en 10 nm sobre y bajo este valor. Estos resultados se exponen en las Tablas 2 y 3.



Tabla 2. Medición de absorbancia entre 555 y 605 nm para el colorante Anilina azul.
𝛌 (nm)
Absorbancia
555
0,024
560
0,024
565
0,025
570
0,027
575...