Cromatografia en columna.

Método de separación en el cual la fase estacionaria se sitúa dentro de un tubo de vidrio.
CLASES DE CROMATOGRAFIA DE ACUERDO AL EQUILIBRIO MEDIANTE EL CUAL SE LLEVA A CABO LA SEPARACIÓN
1. ADSORCION
2. REPARTO
3. INTERCAMBIO IONICO
4. EXCLUSION
5. AFINIDAD
Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases (Cromatografía en Columnacerrada)
Cromatografía de fluidos supercríticos.

Un fluido supercrítico (FSC) es cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico (punto en el cual las densidades del líquido y del vapor son iguales) aquel por encima del cual no se produce licuefacción al presurizar, ni gasificación al calentar; y por ende un fluido supercrítico es aquel que seencuentra por encima de dicho punto. (No hay cambio en la densidad)En términos generales, un fluido supercrítico posee propiedades entre las de un gas y de un líquido.
La selección de las fases depende de la naturaleza química de la muestra y el proceso que se lleve a cabo :
PROCESO
FASE MOVIL
FASE ESTACIONARIA
Reparto (Líquido-Líquido)
Disolventes orgánicos saturados con agua
Sólido desactivadoAdsorción (Líquido-Sólido)
Solventes no polares
Alúmina o geles de sílice
Exclusión (Filtración en gel)
Agua o compuestos orgánicos
Partículas esféricas de un polímero poroso que adsorbe fácilmente agua y otros solventes.
Intercambio Iónico
Agua o compuestos orgánicos
Resinas, geles o celulosa de intercambio iónico
Afinidad
Solución sin ligando
Solución con ligando libre
Ligando unido a soportosólido insoluble

Fase Estacionaria
Alúmina, Gel de silice
Tamaño de partícula grande (mayor de 150 micras de diámetro).

Fase móvil
Una regla general para la elección del solvente es la comparación de las polaridades de las fases y la muestra:
MUESTRA
FASE ESTACIONARIA
FASE MOVIL
POLAR
NO ACTIVA
POLAR
NO POLAR
ACTIVA
NO POLAR

PREPARACION DE LA COLUMNA
El tamaño de la columna estádeterminado por la cantidad de muestra a fraccionar, en una relación adsorbente/muestra de 100:1.
El adsorbente puede introducirse en seco, pero lo más frecuente es en forma de papilla con el eluyente. Se hace de la siguiente manera:
1. Se coloca la columna recta
2. Se le agrega de 2 a 4 cm, por encima de la lana de vidrio, de solvente. Se elimina el aire que puede permanecer retenido en las paredes,agitando por medio de una varilla de vidrio.
3. Se agrega la papilla y se dan pequeños golpecitos a la columna durante el llenado, mediante un tubo de goma, hasta alcanzar la altura deseada.
4. Se abre la llave inferior de la columna para que salga el exceso de disolvente. La altura del disolvente no debe exceder más de 2 a 5 cm sobre el sólido.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra se aplica en formalíquida. Si es necesario se diluye y se aplica directamente.
Si la muestra es sólida, se disuelve en un pequeño volumen de disolvente. El disolvente puede ser el mismo que se utiliza como fase móvil u otro que sea miscible con ella.
Los extractos de tejidos biológicos requieren una purificación preliminar:
Los lípidos se extraen con disolventes orgánicos,
las proteínas pueden precipitarse conalcohol y
las sales con resinas de intercambio iónico.

APLICACIÓN DE LA MUESTRA
Se aplica con una pipeta cuenta gotas.
Cantidad : de 0.5 a 1 cm arriba del lecho de la columna

DESARROLLO
1. Elución. Es la técnica más usada en los distintos métodos cromatográficos.
2. Desplazamiento
3. Análisis frontal

1.- ELUCION. Es el proceso mediante el cual un solvente fluye a través de la columnaproduciendo la separación de los componentes de la mezcla.
Eluyente (efluente): Es la fase móvil portadora de la muestra.
Eluato: Término con el que se define la salida del eluyente.

Dependiendo de los solventes utilizados la elución puede ser:

a) Simple: Es la que se realiza con un solo solvente y es el mismo con el que se empacó la columna.
b) Fraccionada: Se comienza el desarrollo con un...