Cromatografia

GENERALIDADES

La Difracción de Rayos X está basada en las interferencias ópticas que se producen cuando una radiación monocromática atraviesa una rendija de espesor comparable a la longitud de onda de la radiación. Los Rayos X tienen longitudes de onda de Angstroms, del mismo orden que las distancias interatómicas de los componentes de las redes cristalinas. Al ser irradiados sobre la muestraa analizar, los Rayos X se difractan con ángulos que dependen de las distancias interatómicas. El método analítico del Polvo al Azar o de Debye-Scherrer consiste en irradiar con Rayos X sobre una muestra formada por multitud de cristales colocados al azar en todas las direcciones posibles. Para ello es aplicable la Ley de Bragg: nλ = 2d . senθ, en la que “d” es la distancia entre los planosinteratómicos que producen la difracción.

La teoría de dicroismo circular fue desarrollada por Biot y Fresnel (Neumann y Snatzke, 1990). Un rayo de luz polarizado en un plano puede considerarse formado por dos componentes polarizados circularmente, uno a la derecha y el otro a la izquierda. Estos componentes están en fase y son de la misma amplitud. Al pasar por un medio ópticamente activo, cadacomponente interactua de manera diferente con los centros quirales de las moléculas presentes. La interacción de la radiación con la muestra induce un desfasamiento y un cambio de magnitud diferenciales en ambos componentes cirularmente polarizados de la luz, y estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo  y la distorsión de este plano genera una elipse (Figura 7).
Larotación del plano y la diferente absorción de los componetes circularmente polarizados (dicroismo circular) varían de acuerdo con la longitud de onda, pudiéndose obtener espectros de estos fenómenos, esto es, gráficas de la rotación o elipticidad contra la longitud de onda. Los espectros de dicroismo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) ylejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética. En la región del ultravioleta cercano, los cromóforos más importantes son los grupos aromáticos de las cadenas laterales de triptofano, tirosina, y fenilalanina. Ya que la asimetría en estos grupos químicos, se debe exclusivamente a su entorno y como los residuos aromáticos se encuentran distribuidos en toda la macromolécula, los espectros enesta región son un reflejo de la conformación global de la proteína. Además las señales en esta región son extremadamente sensibles a los cambios en la conformación.

Figura 7. Esquema de los componentes de un haz de luz plano-polarizado. (A) Se representan los vectores de los componentes del haz antes de llegar a la muestra. (B) Esos mismos vectores después de interactuar con los solutos de lamuestra, fuera de fase. (C) Los mismos vectores cuando son absortos en forma diferencial.
Los espectros de dicroismo en la región del ultravioleta lejano, se deben principalmente a los enlaces amida que unen los residuos de los aminoácidos entre sí. La asimetría de estos cromóforos se debe al arreglo espacial de la cadena principal de la proteína, por lo cual, las señales de dicroismo circular sepueden interpretar en términos del contenido de estructura secundaria presentes, es decir, del porcentaje de residuos que se encuentran en alguna conformación estructural (hélices , hojas, giros y otros tipos estructurales).
Para realizar este análisis Hennessey y Johnson utilizaron, como base de datos, los espectros de un conjunto de proteínas cuya estructura tridimensional está biendeterminada. A partir de estos espectros, se demostró que basta la combinación lineal de 5 espectros base, para describir a cada uno de los 16 espectros experimentales. Además, se determinó que a cada uno de los 5 espectros base puede asignarsele un contenido de estructura secundaria. El análisis del espectro de dicroismo circular de una proteína cualquiera consiste en encontrar la combinación lineal de...