Enzimas

Caracterización de β-amilasa de soja
INTRODUCCIÓN GENERAL:
El almidón es la principal reserva de carbohidratos en las plantas, el mismo se acumula en las raíces, como puede ser en los tubérculos, así como en algunos frutos y semillas.
Es un polímero de unidades de glucosa que consta de dos fracciones:










Las enzimas capaces de catalizar la hidrólisis del almidón son lasAMILASAS, las cuales pueden ser divididas en dos grupos:
1) Endoamilasas (α-amilasas): hidrolizan uniones α- 1-4, de las regiones internas del almidón, aleatoriamente, liberando estructuras ramificadas de diferentes tamaños, y mono, di y trisacáridos.
2) Exoamilasas (β-amilasas): hidrolizan las uniones α- 1-4, atacando al almidón desde las terminaciones no reductoras de forma secuencial, liberandounidades de maltosa y dextrinas límites.







INTRODUCCIÓN ESPECÍFICA AL PRÁCTICO:
Caracterización de enzimas
Las enzimas son cuantificadas en términos de su actividad biológica. La actividad enzimática puede determinarse midiendo la velocidad de desaparición de sustrato o la velocidad de aparición de producto.
Una forma común y útil de determinar la Actividad Enzimática es en términode Unidades de Enzima (UE), las cuales se definen como: “La cantidad de enzima necesaria para producir determinada cantidad de producto por unidad de tiempo bajo determinadas condiciones de temperatura, pH y concentración de sustrato”.
La concentración de una enzima en solución se expresa por lo general como unidades por mililitro.
La Actividad Específica de una enzima se calcula como elcociente entre la actividad y la concentración de proteínas, y se expresa en general como unidades de enzima por miligramo de proteína (UE/mg proteína).
La velocidad de catálisis de muchas enzimas es descrita por la cinética de Michaelis-Menten, propuesta para un modelo sencillo:
E + S ES E + P
Este modelo sólo es válido cuando la [S] > [E] y para condicionesde estado estacionario ([ES] pequeña y constante).

La ecuación de velocidad, queda definida por: donde y
Para determinar la actividad enzimática, el sustrato debe estar en exceso, de forma de asegurarnos que la enzima se encuentra saturada y que por lo tanto la velocidad enzimática es independiente de [S]. Se considera que estamos en condiciones de saturación cuando [S]≥10Km.
Alreordenar la ecuación de velocidad observamos que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima siempre y cuando se trabaje en condiciones iniciales; dado que solo en ese caso se puede hacer la suposición de que la [S] es constante.
Por lo tanto para medir actividad enzimática en condiciones ideales, tenemos que trabajar no solo en condiciones de saturaciónsino también en condiciones de velocidad inicial, de esta manera nos aseguramos que la medida de actividad enzimática es proporcional a la concentración de enzima.
Las enzimas son muy sensibles a cambios en el medio circundante, por lo que un cambio en el pH o la temperatura, puede afectar profundamente la actividad y estabilidad de una enzima.
Para aproximarnos mejor al trabajo prácticorealizado, explicaremos brevemente que significa el rango de pH óptimo y la estabilidad de una enzima con la temperatura:
pH óptimo: es el pH al cual la enzima presenta su máxima actividad.
Estabilidad térmica: rango de temperatura en el cual la enzima es capaz de retener su actividad catalítica.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS DEL PRÁCTICO:
· Día 1: Medida de Actividad Enzimática y determinación de ActividadEspecífica
· Día 2: Determinación del rango de pH óptimo
· Día 3: Estudio de la estabilidad con la variación de la temperatura
MÉTODOS Y MATERIALES:
ü Medición estimativa de la concentración de proteína. Método espectrofotométrico a λ=280nm
Reactivos:
1. Extracto de soja (E): enzima β-amilasa
2. Buffer actividad (BA): acetato, pH:5,5, 50mM
Materiales:
1. Espectrofotómetro
2. Celda de...