Extraccion Dna
Páginas: 9 (2136 palabras)
Publicado: 21 de febrero de 2013
RAQUEL REY PRIETO
2º GRADO DE CYTA
BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA Nº 1
“AISLAMIENTO DE DNA GENÓMICO”
1. INTRODUCCIÓN:
Para el aislamiento de DNA cromosómico de elevado peso molecular se requiere la ruptura previa de las paredes y membranas celulares, un proceso de purificación y precipitación posterior de sus ácidos nucleicos. Finalmente se realiza la cuantificación y determinaciónde su grado de pureza.
Se obtendrán ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis.
En este tipo de análisis es muy importante evitar lacontaminación de cualquier tipo, ya que se requiere un DNA puro y con las mínimas rupturas. Por ello el uso de guantes para evitar la contaminación con DNasas (enzimas que rompen en DNA); éstas actúan en presencia de magnesio para ello se utilizan sustancias quelantes de este elemento.
Se analizará DNA animal extraído de una muestra de 1 g de hígado; teniendo en cuenta que para esta práctica se puedepartir de cualquier tejido.
2. CUESTIONES:
Esquematiza los diferentes pasos que tienen lugar durante el proceso de extracción y purificación del DNA.
Para el aislamiento del DNA genómico se siguen tres etapas básicas:
RUPTURA O LISIS CELULAR:
Para la extracción los ácidos nucleicos de la muestra es necesario provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separarlos ácidos nucleicos de los restos de células.
Los procedimientos de lisis utilizados son los siguientes:
-Homogenización: rotura mecánica (trituración); mediante un aparato manual (émbolo y vaso, la separación entre ambos debe ser la mínima posible) se realizarán movimientos de arriba abajo y girando.
-Tratamiento químico: En nuestro caso utilizamos SDS 10 %, que es un detergenteaniónico que extrae los lípidos de la membrana y desnaturaliza las proteínas.
-Digestión enzimática: (Proteinasa K, y RNasa). La proteinasa K es una enzima proteolítica de alto espectro, elimina (desnaturaliza) las proteínas. La RNasa elimina los ribonucleótidos.
Los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
PURIFICACIÓN:
Los métodos empleados para purificar losácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de las siguientes técnicas:
Extracción/precipitación;
Cromatografía;
Centrifugación;
Separación por afinidad.
Se suelen utilizar disolventes orgánicos, ya que los ácidos nucleicos son muy solubles.
En nuestro caso se usan varios reactivos que cumplen esta función:
Tampón homogenización: Tris-CIH 50 mM pH:7,6/EDTA 100 mM,
Fenol,
SEVAG: Cloroformo: isoamilalcohol (24:1).
CONCENTRACIÓN:
Para ello se utiliza etanol en frío y siempre en presencia de sales (NaCl, Acetato Sódico). Para que precipite el DNA.
Por último se harán dos tipos de evaluación de las muestras obtenidas:
-Cuantitativa: con el espectrofotómetro
-Cualitativa: con electroforesis en un gel de agarosa¿Para qué se utiliza el SDS, la proteinasa K y la RNasa? ¿ Y los disolventes orgánicos? Explica el fundamento en cada reactivo.
SDS al 10%: (DODECILSULFATO SÓDICO)
Se trata de un detergente aniónico que extrae los lípidos de membrana, con que que facilita la lisis celular, y rompe enlaces no covalentes en las proteínas provocando la pérdida de funcionalidad de éstas.
Las moléculas de estedetergente se unen a las zonas apolares de la cadena polipeptídica.
A demás el SDS proporciona al polipéptido una carga negativa que es mayor a la carga de la proteína, y provoca la pérdida de la conformación nativa de dicha proteína.
PROTEINASA K:
Se trata de una enzima proteolítica de elevado espectro , tiene dos funciones; uno es degradar (desnaturalización) de las proteínas...
2º GRADO DE CYTA
BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA Nº 1
“AISLAMIENTO DE DNA GENÓMICO”
1. INTRODUCCIÓN:
Para el aislamiento de DNA cromosómico de elevado peso molecular se requiere la ruptura previa de las paredes y membranas celulares, un proceso de purificación y precipitación posterior de sus ácidos nucleicos. Finalmente se realiza la cuantificación y determinaciónde su grado de pureza.
Se obtendrán ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis.
En este tipo de análisis es muy importante evitar lacontaminación de cualquier tipo, ya que se requiere un DNA puro y con las mínimas rupturas. Por ello el uso de guantes para evitar la contaminación con DNasas (enzimas que rompen en DNA); éstas actúan en presencia de magnesio para ello se utilizan sustancias quelantes de este elemento.
Se analizará DNA animal extraído de una muestra de 1 g de hígado; teniendo en cuenta que para esta práctica se puedepartir de cualquier tejido.
2. CUESTIONES:
Esquematiza los diferentes pasos que tienen lugar durante el proceso de extracción y purificación del DNA.
Para el aislamiento del DNA genómico se siguen tres etapas básicas:
RUPTURA O LISIS CELULAR:
Para la extracción los ácidos nucleicos de la muestra es necesario provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separarlos ácidos nucleicos de los restos de células.
Los procedimientos de lisis utilizados son los siguientes:
-Homogenización: rotura mecánica (trituración); mediante un aparato manual (émbolo y vaso, la separación entre ambos debe ser la mínima posible) se realizarán movimientos de arriba abajo y girando.
-Tratamiento químico: En nuestro caso utilizamos SDS 10 %, que es un detergenteaniónico que extrae los lípidos de la membrana y desnaturaliza las proteínas.
-Digestión enzimática: (Proteinasa K, y RNasa). La proteinasa K es una enzima proteolítica de alto espectro, elimina (desnaturaliza) las proteínas. La RNasa elimina los ribonucleótidos.
Los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
PURIFICACIÓN:
Los métodos empleados para purificar losácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de las siguientes técnicas:
Extracción/precipitación;
Cromatografía;
Centrifugación;
Separación por afinidad.
Se suelen utilizar disolventes orgánicos, ya que los ácidos nucleicos son muy solubles.
En nuestro caso se usan varios reactivos que cumplen esta función:
Tampón homogenización: Tris-CIH 50 mM pH:7,6/EDTA 100 mM,
Fenol,
SEVAG: Cloroformo: isoamilalcohol (24:1).
CONCENTRACIÓN:
Para ello se utiliza etanol en frío y siempre en presencia de sales (NaCl, Acetato Sódico). Para que precipite el DNA.
Por último se harán dos tipos de evaluación de las muestras obtenidas:
-Cuantitativa: con el espectrofotómetro
-Cualitativa: con electroforesis en un gel de agarosa¿Para qué se utiliza el SDS, la proteinasa K y la RNasa? ¿ Y los disolventes orgánicos? Explica el fundamento en cada reactivo.
SDS al 10%: (DODECILSULFATO SÓDICO)
Se trata de un detergente aniónico que extrae los lípidos de membrana, con que que facilita la lisis celular, y rompe enlaces no covalentes en las proteínas provocando la pérdida de funcionalidad de éstas.
Las moléculas de estedetergente se unen a las zonas apolares de la cadena polipeptídica.
A demás el SDS proporciona al polipéptido una carga negativa que es mayor a la carga de la proteína, y provoca la pérdida de la conformación nativa de dicha proteína.
PROTEINASA K:
Se trata de una enzima proteolítica de elevado espectro , tiene dos funciones; uno es degradar (desnaturalización) de las proteínas...
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