Metodologia Bioquimica

METODOLOGÍA BIOQUÍMICA

1. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS:
La proteína que se va a purificar es la glutamina sintetasa (GS) de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803. La GS cataliza la síntesis de glutamina a partir de amonio y glutamato mediante la llamada reacción biosintética, aunque también puede catalizar una reacción no fisiológica, la γ-glutamil transferasa:ADP, Pi o AsO=
L-Gln + NH2OH γ-Glutamil hidroxamato + NH3
Me++

La actividad transferasa es superior a la biosintética y además el ensayo transferasa es cuantificable espectrofotométricamente.
La GS de Synechocystis sp PCC 6803 se obtiene a partir de cultivos de E.Colipreviamente transformados con un plásmido que contiene el gen de la GS (glnA). De este modo la proteína estará sobreexpresada y su purificación será más fácil.
El primer paso en cualquier purificación de proteínas es la rotura de las células para liberar sus proteínas en una solución denominada extracto crudo. Cuando el extracto está a punto, se dispone de diversos métodos para purificar una o más delas proteínas que contienen. Normalmente el extracto se somete a tratamientos que separan las proteínas en diferentes fracciones según alguna propiedad tal como el tamaño o la carga, un proceso que se denomina fraccionamiento.
El método que vamos a usar para fraccionar proteínas va hacer la cromatografía de intercambio iónico, que es un tipo de cromatografía de adsorción basada en la separaciónde moléculas en función de su carga neta. La separación se produce por la adsorción reversible de las moléculas cargadas de la muestra por los grupos inorgánicos de carga opuesta inmovilizados en la fase estacionaria. La carga neta de una proteína dependerá de la proporción de grupos cargados positiva y negativamente que tenga, y esta proporción varía con el pH del medio.
Las matrices deintercambio iónico (polímeros sintéticos) se clasifican en:
Aniónicas: cargadas positivamente para la adsorción de proteínas aniónicas.
Catiónicas: cargadas negativamente para la adsorción de proteínas catiónicas.
La fase móvil está formada por iones de baja masa molar denominados contraiones, que suele ser Na+ e H+ para los intercambiadores catiónicos y Cl- y OH- para los aniónicos. Los contraionesse pueden disociar, por lo que no están permanentemente unidos a su grupo ionogénico, sino que está en equilibrio entre la fase móvil y los grupos intercambiadores de la fase estacionaria. Durante el intercambio iónico pueden producirse cambios en el pH y maximizar la capacidad de absorción.
La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza en dos fases:
a) Unión fuerte de la sustanciaa separar con el intercambiador.
b) Elución de los componentes unidos a la matriz mediante tampones de diferentes pH y/o diferente fuerza iónica.

Protocolo:

Preparación de la matriz de la columna de cromatografía:
Cerrar la salida de la columna con unas pinzas.
Añadir intercambiador aniónico (DEAE celulosa), el cual está cargado positivamente para la adsorción de la proteína GS con carganegativa.
Abrir y cerrar la pinza para que la columna vaya decantando.
Añadir 5 ml de tampón HEPES 50 mM, pH 7.
Abrir la pinza y dejar que baje el nivel de tampón hasta que no quede más que 1 mm de líquido por encima del lecho de la matriz.
Aplicación de la muestra y lavado:
Reservar 200 µΙ de la muestra guardándola en un tubo eppendorf a -20ºC y aplicar el resto (800 µΙ) de lamuestra encima del lecho de la columna y dejar que entre en la matriz, de manera que la proteína GS desplaza a los contraiones y se adsorbe reversiblemente a la matriz.
Las proteínas con la misma carga que la matriz no se unen y son eluidas mediante lavado con 30 ml de tampón HEPES 50 mM, pH 7.

HEPES: 1 M 1000mM
30 ml de tampón HEPES 50 mM

C.V = C’.V ’...