Prueba Inmunoflorecencia Y Elisa

Pruebas de Inmunofluorescencia
Que es?
Las pruebas de inmunofluorescencia (IF) se basan en que, cualquier antígeno, puede ser marcado específicamente con un fluorocromo coloreado, a través de un anticuerpo (Ac) específico. Cuando se irradia este elemento con luz ultravioleta o azul se hace fluorescente.
Propiedades
* Alta especificidad, por lo que se unen fuertemente.
* Altaselectividad, por lo que pueden diferenciar dos antígenos muy similares.
* Alta sensibilidad, porque pueden detectar cantidades muy bajas de antígeno.
* Estequiometricidad, existe una proporción entre la cantidad de antígeno y la cantidad de reacción antígeno !anticuerpo.
Propósito
El propósito de estas técnicas es el de localizar el complejo específico antígeno!anticuerpo, ya que éstos noson visibles directamente al microscopio. Se han desarrollado varios métodos, directos e indirectos, para la detección del complejo Ag!Ac.
Tecnicas de inmunofluorescencia
Las pruebas de inmunofluorescencia (IF) se basan en que, cualquier antígeno, puede ser marcado específicamente con un fluorocromo coloreado, a través de un anticuerpo (Ac) específico. Cuando se irradia este elemento con luzultravioleta o azul se hace fluorescente. Dos de los métodos utilizados son:
Método directo
La directa emplea anticuerpos fluoresceinados que se uunen a los antígenos objeto de estudio y los hacen visibles bajo la luz ultravioleta.
Método indirecto
Las pruebas indirectas son mas complicadas al estar diseñadas para detectar anticuerpos, en vez de antígenos. Para ello se debe preparar unasolución de anticuerpos fluorescentes que se unan al anticuerpo objeto de estudio. Aunque parezca paradójico que un anticuerpo se una a otro anticuerpo realmente no lo es. Esta prueba contiene un anticuerpo fluorescente que se une, y se pone de manifiesto, al tipo de anticuerpo que se quiere identificar en la muestra clínica.

 MÉTODO DE REALIZACIÓN
 Cubrimos dos de las extensiones con 10l detampón BABS (testigo conjugado), otros dos con 10l de sorbente (testigo sorbente). Cubrimos las otras extensiones con 10l de cada dilución de los sueros problemas y los sueros testigos.
 Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. Lavamos en PBS-Tween 2 veces durante 5 minutos. Enjuagamos rápidamente en un baño de agua destilada. Escurrimos y dejamos secar.
 Cubrimos cada extensión de10l de globulina anti-humana diluida en tampón BABS.
 Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. Lavamos los portas en PBS-Tween 2 veces durante 5 minutos. Pasamos rápidamente por un baño de agua destilada. Dejamos secar.
 Observación de los resultados en microscopio de campo oscuro.
 RESULTADOS
Resultados esperados
En los pocillos en los que se añadió suero con anticuerposfrente a T. pallidum éstos se unirán a los antígenos de T. Pallidum contra los que son específicos, y al añadir el complejo antiinmunoglobulina G marcado, se unirá a los anticuerpos. Al mirar en el microscopio de campo oscuro. Se observará fluorescencia.
En los pocillos en los que el suero añadido no lleva anticuerpos frente a T. Pallidum no se unirá al antígeno, y al añadir la antiinmunoglobulina Gmarcada éste tampoco se unirá al anticuerpo. No se observará fluorescencia.
Resultados observados
Podemos observar en el microscopio de campo oscuro células treponémicas de color verde debido a la fluorescencia; por tanto, concluiremos decidiendo que
Se observan treponemas en las muestras estudiadas

Usos
Las pruebas de inmunofluorescencia pueden utilzarse para detectar
anticuerpos o paradetectar la presencia de un patógeno. se puede utilizar para el diagnostico de la sífilis y varicela zoster y entre otras muchas infecciones
limitaciones
Al igual que la mayoría de las técnicas de fluorescencia, un problema muy significativo con la inmunofluorescencia es el fotoblanqueo. Es decir la pérdida de la actividad fluorescente causada por la exposición a la luz. Esta pérdida de...