Reporte 1 Métodos

Determinación de proteínas por el método de Lowry y Bradford

Fundamento
(El método de Lowry consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína,exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principalconstituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.) (1)

(La determinación de proteínas por el método de Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rápida, barata y sensible. El método se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassiebrillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia máxima a 470 nm. A diferencia del método de Lowry que es muy sensible a la composición de la solución que acompaña a las proteínas, el método de Bradford sólo es afectado poralgunos detergentes. Una de las desventajas de este método es que el colorante CBBG se une fuertemente a las celdas de cuarzo. Por esto se recomienda usar celdas de vidrio o de polipropileno. Al usar celdas de polipropileno se facilita su limpieza con un poco de alcohol.) (2)











Objetivos
a) Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando dos métodosfotométricos.
b) Determinará el efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pueden inferir en los métodos ensayados.
c) Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud en el método de Bradford respecto al de Lowry.

Resultados

Datos del espectrofotómetro
Marca: Thermo Spectronic
Modelo: Genesys 20
Equipo: 9 (Lowry) y 10 (Bradford)

Método de Lowry
Tabla 1.1Curva de calibración de albúmina. Método de Lowry
Tubo No.
Cantidad de proteína µg
Absorbancia 590 nm


Serie a
Serie b
1
25
0,025
0,068
2
50
0,118
0,12
3
75
0,157
0,164
4
100
0,215
0,208
5
125
0.149
0,241











La curva cumple con la Ley de Bouger y Beer ya que existe una relación directamente proporcional entre la cantidad de proteína (límites de 25-125 µg) y la absorbancia registrada.Tabla 1.2 Réplicas para el análisis estadístico
Tu No.
Absorbancia 590
Cantidad de proteína (µg)
1
0,129
58,23
2
0,158
75,29
3
0,17
82,35
4
0,11
47,06
5
0,101
41,76
6
0,179
87,65
7
0,151
71,18
8
0,149
70,00
9
0,173
84,12
10
0,124
55,29

Tabla 1.3 Resultado del análisis estadístico
Media
S
S2
%C.V.
µ
67.29
15.97
255.34
23.73%
55.86-78.71

Tabla 1.4 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en elmétodo de Lowry
Tubo No.
Sustancia
Absorbancia 590
Cantidad de proteína (µg)
Tipo de interferencia generada
1
Tris 1 M, pH 7
0.126
56.47
No hay
2
Glicerol al 1%
0.200
100
Positiva
3
Detergente comercial al 1%
0.157
74.7
No hay
4
Dodecil sulfato de sodio (SDS)al 1%
0.137
62.94
No hay
5
Ácido tricloroacético (TCA) al 5%
0.161
77.05
No hay
6
Fenol al 1%
1.438
828.23
Positiva
7
Mercaptoetanol al 1%
0.251130
Positiva
8
Tris 1 M, pH 10
0.189
93.52
Positiva
9
Urea al 5%
0.151
71.17
No hay
10
(NH4)2SO4 al 3%
0.176
85.88
Positiva

Método de Bradford
Tabla 2.1 Curva de calibración de albúmina. Método de Bradford
Tubo No.
Cantidad de proteína (µg)
Absorbancia 595 nm


Serie a
Serie b
1
25
0,311
0,323
2
50
0,44
0,478
3
75
0,549
0,605
4
100
0,688
0,694
5
125
0,781
0.692











La curva cumple...