Sintesis De Lactasa

_________________________________________________________Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XV, Nº 5, 476 - 482, 2005

OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE LA LACTASA DE Kluyveromyces marxianus ATTC 8554, PARA SU APLICABILIDAD EN LA INDUSTRIA LÁCTEA
Optimization of the Process of Extraction of Lactase From Kluyveromyces marxianus ATTC 8554, for their Applicability in the Dairy IndustryXiomara Montiel, Ingrid Carruyo, Letty Marcano y Marcel Mavárez Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Apartado 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. E-mail: xyo_mon@hotmail.com; xyo_mon@cantv.net.

RESUMEN
La lactasa o b-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima exclusivamente intracelular en Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, por lo que para suliberación existen diversos métodos de extracción. El objetivo del presente trabajo consistió en optimizar el proceso de extracción de esta enzima para su uso en la industria láctea. La producción de la enzima fue inducida mediante el crecimiento de la levadura en un medio con lactosa como única fuente de carbono por 9 horas, donde alcanzó la fase logarítmica final de crecimiento. Se evaluó lacombinación de los parámetros fisicoquímicos: temperaturas 30; 37 y 42°C; pH 6,5; 8,5 y 10 y tiempo 5; 10 y 20 horas con el método de extracción con tolueno al 2% en buffer fosfato 0,1M. Se determinó la actividad enzimática de la lactasa a través del uso de un sustrato cromógeno el o-nitrophenyl-b-D-galactopyranosido (ONPG) sobre los extractos libres de células. Se determinó la cantidad de proteínastotales por el método de Lowry, que permitió la valoración de la actividad específica. Los resultados fueron analizados empleando el paquete estadístico Statgraf versión 7,0, aplicando análisis de varianza trifactorial, LSD y prueba de Tukey. El análisis por microscopía electrónica de transmisión (MET) de las células de K. marxianus reveló que el tolueno ejerce un efecto permeabilizante, liberandola enzima sin ruptura de la integridad celular. Se encontró un acortamiento significativo (P £ 0,01) en el tiempo necesario para la extracción de la lactasa, siendo la mejor combinación: 37°C, pH 6,5 y 5 horas, generando en este tiempo la mayor cantidad de ONP: 0,4937 µmoles/mL/10 min. y la mayor actividad específica 34,2095 Ub-gal/mg proteínas. Palabras clave: Lactasa, Kluyveromyces marxianus,extracción.

ABSTRACT
The lactase or b- galactosidasa (EC 3.2.1.23) it is an exclusively intracellular enzyme in Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, so that, to obtain it, there are several methods to the extraction. The objective of this work consisted on optimizing the process of extraction of this enzyme, and it can be its used in the dairy industry. The enzyme production was induced whileyeast growth in a means with lactose as the one carbon source for 9 hours, where it reached the phase logarithmic end of growth. The physiochemical parameters combination was evaluated: temperatures 30; 37 and 42°C; pH 6.5; 8.5 and 10 and time 5; 10 and 20 hours using the extraction method with toluene to 2% in buffer phosphate 0.1M. The enzymatic activity of the lactase was determined with the use ofcromogen substrate the or-nitrophenyl b-D-galactopyranoside (ONPG) on the extracts free of cells. The quantity of total proteins was determined by the method of Lowry that allowed the valuation of the specific activity. The results were analyzed using the statistical package Statgraf version 7.0, applying variance trifactorial analysis with a single effect, LSD, Tukey test. The analysis for TEMof the cells of K. marxianus revealed that the toluene produced a permeabilizant effect, liberating the enzyme without rupture of the cellular integrity. It was found that there was a significant reduction in the necessary time to the extraction of the b-D galactosidasa of the cells of K. marxianus, being the best combination: 37°C, pH 6.5 and 5 hours, generating in this time the biggest quantity...