TP6 Microscopia

MICROSCOPÍA
Trabajo Práctico N°
N 6
MICROBIOLOGÍA
(Octubre 2012)
Claudia Herrmann
cherrmann@iibintech.com.ar

1

MICROSCOPÍA
Campo claro
Campo oscuro
Microscopio Óptico

Contraste de fase
Fluorescencia
Confocal

Microscopio Electrónico

De transmisión (MET)
De barrido (MEB)

Microscopio de Fuerza Atómica

2

3

1) Microscopio de campo claro
Ocular (X10)

Objetivo
(X20, X40, X60, X100)Muestra

Condensador
Fuente
L
Luz

4

1) Microscopio de Campo Claro
La muestra debe ser delgada (casi transparente)  Fijación  Tinción
Para aumentar la diferencia de contraste entre los microorganismos
y el medio en las muestras es necesario realizar tinciones.

Levaduras sin teñir

Bacterias Tinción Gram

5

2) Microscopio de campo oscuro
Objetivo

- Se coloca una placa opaca en el
condensador.
d
d- Solo los rayos
y reflejados
j
o
difractados entran al objetivo.

Muestra

- Se obtiene una imagen con fondo
oscuro y la muestra iluminada.

Condensador
Placa Opaca
Fuente
Luz

- No es necesario fijar las muestras
(Buen contraste entre la muestra y el
fondo)

6

FUNDAMENTO
Rayos No
Desviados

Lente del Objetivo

Rayos Desviados
por la muestra
Muestra

Lente del
Condensador
Placa Opaca

Fuente deLuz

7

Campo Claro

Levaduras

vs.

Campo Oscuro

Chlamydomonas

8

3) Microscopio de Contraste de fase
Anillo de fase

Objeetivo

- Se basa en el retraso de las ondas de luz al
atravesar objetos de distintos índices de refracción
(densidades), aprovechando y amplificando dichos
retrasos.
- Convierte
C i t pequeñas
ñ dif
diferencias
i en ííndices
di
d
de
refracción variables y detectables porel ojo.

Muestra

- Permite observar estructuras sin necesidad de
fijar las muestras.
- Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas de la muestra; las partes
claras de la imagen corresponden a porciones
menos densas

Condensador

Disco Anular
Fuente
Luz

9

3) Microscopio de Contraste de Fase
La luz,, al atravesar objetos
j
con distintos índices de refracción,,experimenta
p
retrasos
(desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder percibirlos.
El MCF, mediante el diafragma anular y el anillo de fase, acentúa dichos retrasos,
haciendo que zonas con distintos índices de refracción se traduzcan en una variación
de contraste la cual puede ser observado.

rayos
en fase

-1/4
/

Se observan imágenes
con el fondo claro
(rayos no desviados) y
lasmuestras oscuras
con limites bien
definidos.

-1/4

ANILLO DE FASE

Objetivo

Los rayos desviados se
cancelan con los no desviados

Discos transparentes
con un diseño en relieve

10

3) Microscopio de Contraste de Fase
Cél l Vi
Células
Vivas
Microscopio
p de
Campo Claro

p de
Microscopio
Contraste de Fase

• No hay buen contraste con el fondo • Buen contraste de células con el fondo
• No se observan haylímites claros
• Límites celulares evidentes (oscuros)
• No se distinguen estructuras internas • Se distinguen estructuras internas

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4) Microscopio de fluorescencia

Filtro de emisión

Muestra

Condensador de
Campo Oscuro

Lámpara
p
Filtro de
excitación

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MUESTRAS
- Pueden presentar autofluorescencia ó estar teñidas con fluoróforos:
- Anticuerpos
A ti
conjugados
j d
- Hoecht (tiñe DNA)
-Expresión de proteínas de fusión fluorescentes (GFP)
- Pueden estar vivas o fijadas  Microscopio Invertido

- Son exitadas excitadas a una longitud de onda y fluorescen emitiendo a una longitud
de onda mayor.

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5) Microscopio confocal
- Las muestras deben estar teñidas
con fluoróforos o presentar
autofluorescencia
- Las muestras pueden estar vivas o
fij d
fijadas
- Las muestras son excitadasa una
longitud de onda y fluorescen
emitiendo a una longitud de onda
mayor.
- Solo
S l llos h
haces d
de lluz que pasan por
el foco llegan al detector.
planos
- Se observan planos.

14

5) Microscopio confocal
- Un Rayo Láser se hace pasar a través
del pinhole, este haz de luz pasa a
través del espejo y luego a través del
l t objetivo
lente
bj ti ell cuall llo enfoca
f
sobre
b lla
muestra.
-...