Transformación Nicotina Tabaco

Transformación de plantas de NICOTIANA TABACUM usando el método de transformación de hojas (Horsch et al 1988).


Se esterilizan las semillas y se ponen a germinar en medio MS 1X sacarosa2‘5% (pH 5,7) agar 0,7%.
Se usan plantas de aproximadamente 20 dias crecidas en condiciones esteriles.

Se crecen pre-inóculos con los correspondientes cultivos de Agrobacterium tumefacienscon los correspondientes antibióticos de selección durante la noche a 28 ºC. Con dichos pre-cultivos se inocula medio nuevo y se deja creciendo a 28ºC durante el tiempo suficiente hasta que alcanza unadensidad óptica a 600 nm de 0,5-0,8.

Se cortan discos o cuadrados de las hojas (de las plantas crecidas en condiciones estériles), de aproximadamente 8 mm de longitud. Se dejan los discos conagitación suave en el cultivo durante 1 hora.
Los discos de hojas se secan en papel de filtro y se pasan a placas con medio de co-cultivo (con el haz tocando la superficie de la placa): MS 1Xsacarosa 2’5% (pH5,7) plant-agar 0,7% más las hormonas de inducción de callos: BAP 1 mg/L y NAA 0,1 mg/L. Se recomienda romper el medio con las pinzas antes de colocar los discos de hoja para mejorar elcontacto del material vegetal con el medio. Estas placas se mantienen a 25 ºC en oscuridad durante dos días.

Pasado el período de co-cultivo de la planta con Agrobacterium tumefaciens los discosse pasan a placas de generación de brotes: MS 1X sacarosa 1% (pH5,7) plant-agar 0’7% BAP 1 mg/L y NAA 0,1 mg/L al que se le añaden los antibióticos correspondientes: 100 mg/L de Kanamicina para laselección de las plantas transgénicas y 500 mg/L de Claforán o Cefotaxime para impedir el crecimiento posterior del agro.

Los explantes se mantienen en este medio a una Tª de aprox. De 25ºC,cambiándose el medio de selección cada semana.
Al cabo de 3-4 semanas, los brotes desarrollados se escinden con la ayuda de un bisturí y se pasan a medio de regeneración MS 1X sacarosa 2,5% (pH5,7)...