Vectores de clonacion

VECTORES DE CLONACIÓN

Como se mencionara más arriba, un vector es una molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de interés y permitirá su amplificación. Los vectores de clonación más utilizados derivan del genoma viral o de plásmidos bacterianos. Un vector de clonación tiene tres componentes esenciales:

1. Un origen de replicación

2. Un gen marcador fácilmente seleccio-nable

3. Almenos un sitio único de restricción

Los vectores de clonación de última generación son muy prácticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio múltiple de clonación o sitio de restricción múltiple («polylinker»), que es un segmento corto de ADN con muchos sitios de restricción diferentes, cada uno de ellos único para el vector (Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte del marco abierto delectura («ORF») de un gen responsable de alguna característica fenotípica, por lo que resulta sencillo confir-mar si tras la restricción y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN, ya que la inclusión de este interrumpe la se-cuencia del vector, lo cual redunda en la pérdida de funcionalidad del gen mediante inactivación por inserción.
Los vectores pueden clasificarse de la siguientemanera:

A) Plásmidos:
son moléculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosómicas, presentes en las bacterias, que poseen pro-piedades muy útiles como vectores de clonación:
1. Pequeño tamaño que permite mayor facilidad de aislamiento y manipulación.
2. Son circulares, lo que hace que el ADN sea más estable durante su aislamiento químico.
3. Su replicación transcurreindependientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana.
4. Existen múltiples copias en la célula, dependiendo del plásmido y de la especie hospedadora, puede haber de varias a nu-merosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias de pBR322 por célula).

5. La presencia de genes de resistencia a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y selección de los clones que loscontienen.
6. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plásmido se hace generalmente inestable .

Aunque en el ambiente natural los plásmidos conjugativos generalmente se transfieren por contacto célula a célula, los plásmidos vectores de clonación generalmente han sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugacióny así lograr su contención biológica.

B) Bacteriófagos o fagos:
Fago λ : tiene un mapa genético complejo. Se conoce la secuencia completa de sus 48.502 pares de nucleótidos y la función de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). Esa partecentral (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo (Fig. 4 A). La molécula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro. Las partículas del fago pueden inyectar el ADN recombinante en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos aclonar.
El fago l silvestre no es indicado como vector de clonación porque tiene demasiados sitios para enzimas de restricción. Para obviar esta dificultad se han construído fagos l modificados (Charon), en los cuales los sitios de restricción no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca.
Es un vector de clonación particularmente útil porque:
1. Seconoce bien su estructura, secuencia y funcionamiento
2. Puede insertar mayor cantidad de ADN que la mayoría de los plásmidos (entre 10 y 20 kb)
3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partículas del fago
4. Las partículas del fago son mucho más eficientes en la infección de las células hospedadoras (transfección) que la transformación.
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