Actividad de la enzima citocromo oxidasa en tejidos de rata

Laboratorio numero 3
ACTIVIDAD DE LA ENZIMA CITOCROMO OXIDASA EN TEJIDOS DE RATA

Objetivos:
1. Demostrar la actividad de la enzima citocromo oxidasa presente en el corazón de rata
2. Demostrar la inhibición de la enzima citocromo oxidasa de corazón de rata por efecto de cianuro de potasio(KCN).
3. Valorar a través del análisis del experimento, la importancia del citocromo oxidasa en lacadena respiratoria.

Material equipo y reactivos utilizados

Material:
1 estuche de disección
1 mortero y pistilo
1 tubo de centrifuga
1 espátula
1 pipeta de 5mL
1 pipeta serológica 10 mL
4 pipetas serológicas de 1 mL
5 tubos de ensayo
1 gradilla para tubos

Reactivos:
Fosfato disodico 1/5 M (Na2HPO4)
Cianuro de potasio 0.01% (KCN)
P – fenilendiamina al 0.2%
Arena

Equipo1 campana de vidrio
1 centrifuga
Hielo

Procedimiento
Se preparara un extracto de citocromo oxidasa a partir de tejido cardiaco de rata, pero debido a que las enzimas pierden actividad rápidamente después de la muerte del animal, el corazón deberá ser extraído de inmediato y deberá prepararse el extracto enzimático lo mas pronto posible.

Cada lado de mesa deberá disponer de una rata(grande o mediana) que anestesiaran colocándola en una campana que contiene cloroformo hasta que observen que la rata esta completamente dormida. Además deberán de traer un estuche de disección y guantes para efectuar la disección.
1. abra el tórax y abdomen del animal

2. Extraiga el corazón y cortelo en pequeñas porciones con una tijera y colóquelas en un mortero

3. Agregue aproximadamente unacantidad similar de arena y 4 mL de Na2HPO4 (fosfato disodico) 1/5 M

4. Triture la mezcla hasta obtener una pasta fina y agregue 8 mL mas de Na2HPO4 1/5 M. deje reposar durante 20-30 min. En baño de hielo, agitando ocasionalmente

5. Centrifugue por 10 minutos y separe el sobrenadante colocándolo en un tubo que rotulara: “preparación de citocromo oxidasa”.

NOTA: mientras no se utilicen lostejidos o sus extractos, deberán mantenerse en baño de hielo.

6. prepare tres tubos de la manera siguiente:

Tubos mL de preparación mL de KCN* al 0.01% mL de H2O destilada mL de p – fenilendiamina
Citocromo oxidasa (veneno) Al 0.2%
1 1 0 1 1
2 1 1 0 1
3 0 0 2 1

Agite los tubos frecuentemente y note cualquier cambio de color.

Precaución: por ser una sustancia venenosa, lasolución de KCN nunca se pipetea, sino que deberá extraerse por capilaridad con pipeta serológica 5 mL. Los resultados de la reacción se observaran entre 15 y 45 minutos.

PREGUNTAS
1) ¿cual es la razón por la que se utiliza tejido cardiaco en este experimento?

2) ¿Porque este se debe procesar rápidamente?

3) ¿Observa alguna diferencia de color en los tubos? Si su respuesta es si, explique cuales esa diferencia.

4) ¿En cual tubo se evidencia la enzima actividad de la enzima estudiada y por qué?

5) ¿Cuál fue el resultado del tubo 2? Explíquelo

6) Escriba la función de cada reactivo.

Observaciones

Conclusiones

Revisión bibliografica

Oxidación biologica

Desde el punto de vista químico, la oxidación se define como la remoción de electrones, y la reducción como laganancia de estos.
La oxidación siempre es acompañada de la reducción de un aceptor de electrones. Este principio de la oxidación-reducción se aplica por igual a los sistemas bioquímicos y constituye un concepto importante para la comprensión de la naturaleza de la oxidación biológica.

Importancia biomédica

La utilización principal del oxigeno, tiene lugar en la respiración, que puededefinirse como el proceso mediante en cual las células obtienen energía en forma de ATP a partir de la reacción controlada del hidrogeno con oxigeno para formar agua. Ademas, el oxigeno se incorpora a diversos sustratos mediante las enzimas denominadas oxigenasas; muchos fármacos contaminantes y carcinógenos químicos (xenobioticos), se metabolizan por la enzimas de esta clase, mejor conocidas como el...