Actividad a-amilasa en semillas de cebada durante la germinación
Páginas: 6 (1469 palabras)
Publicado: 6 de abril de 2014
Dep. de Cs. Biológicas.
Práctico N° 6
Actividad a-amilasa en semillas de cebada durante la germinación
Laboratorio de Fisiología celular
BIO 135 sección 300
Carrera: Ingeniería en BiotecnologíaProfesoras:
Fecha práctico: Miércoles 15.06.11
Integrantes:
, 22 de Junio 2011
Introducción
El almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, estas lo almacenan como alimento en raíces, tubérculos, frutas y semillas.
En las semillas de cebada y deotras gramíneas, inmediatamente debajo de la cubierta seminal hay una capa de células endospermicas especializadas llamada aleurona. (1)
Las células de la aleurona son ricas en proteínas, cuando la semilla comienza su germinación se inicia la liberación de enzimas hidrolíticas como la α-amilasa, para la hidrólisis del almidón en respuesta a la liberación de giberelinas por parte del embrión.(2)Las enzimas digieren las reservas alimenticias que están almacenadas en el endosperma, rico en almidón. Estas reservas se liberan en forma de azucares y aminoácidos, el escutelo los absorbe y los transporta a las regiones del embrión que están en desarrollo, de este modo el embrión obtiene los nutrientes que necesita para su crecimiento en el momento requerido.
La β-amilasa también ayuda en elproceso de degradación del almidón actuando desde el extremo no reductor de la cadena (exoamilasa), catalizando la hidrólisis del segundo enlace α-1,4 para producir maltosa. (3)
La lectura de diferentes genes puede generar enzimas de distinta estructura conformacional pero con una misma función, esta similitud entre enzimas se denomina isoenzimas.
Las isoenzimas se pueden diferenciar enlaboratorio por medio de una electroforesis, para ello existen dos tipos de isoenzimas, las que emigran a bajo punto isoeléctrico y las que emigran a alto punto isoeléctrico, esta característica permite estudiar en profundidad la acción de las enzimas.(4)
Para la visualización de proteínas se realiza una electroforesis nativa que consiste en una serie de técnicas para la separación individual deproteínas, complejos proteicos y supercomplejos. Interacciones proteína-proteína fijas y estables pueden ser detectadas dependiendo de las condiciones experimentales utilizadas (detergentes y soluciones amortiguadoras)
La absorbancia es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra, se utiliza para calcular la concentración y es proporcional al grosor de la muestra y a la densidad de esta, eneste caso la diferencia de pesos moleculares entre las distintas isoformas permitirá la cuantificación de las mismas.
En función a lo aprendido tendremos como objetivos principales, la cuantificación de α-amilasa en extracto de semillas de cebada por medio de espectrofotometría e identificar la α-amilasa de cebada mediante electroforesis nativa.
Materiales y métodos
Materiales:Semillas de cebada, Micropipetas, centrífuga, espectrofotómetro, tubos falcon, tubos de 1,5 mL, tubos de 0,5 mL, baño termorregulado, cubeta con hielo, cámara de electroforesis, buffer de carga, 5 mL gel separador 8% (2,35 mL agua destilada, 1,3 acrilamida, 1,3 mL Tris 1,5 M pH 8,8, 50 uL APS 10 %, 3 uL TEMED), 3 mL gel concentrador 5% (2,13 mL agua destilada, 500 uL acrilamida, 380 uL Tris 1 MpH 6,8, 30 uL APS 10%, 3 uL TEMED), Buffer electroforesis nativa (0.025% Tris 0.19 M glicina pH 8,8, H2O hasta completar 1000 mL), solución para teñir (Azul de Coomasie R-250 0,25%), Solución A (acetato de sodio 50 mM, pH 4,8, almidón soluble 0.03 %, NaCl 60 mM, CaCl2 20 mM), Solución B (KI : I2 = 6 :0,6 % (w/v), Solución C.
Método experimental:
1. Se extrajo la cubierta de las...
Dep. de Cs. Biológicas.
Práctico N° 6
Actividad a-amilasa en semillas de cebada durante la germinación
Laboratorio de Fisiología celular
BIO 135 sección 300
Carrera: Ingeniería en BiotecnologíaProfesoras:
Fecha práctico: Miércoles 15.06.11
Integrantes:
, 22 de Junio 2011
Introducción
El almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, estas lo almacenan como alimento en raíces, tubérculos, frutas y semillas.
En las semillas de cebada y deotras gramíneas, inmediatamente debajo de la cubierta seminal hay una capa de células endospermicas especializadas llamada aleurona. (1)
Las células de la aleurona son ricas en proteínas, cuando la semilla comienza su germinación se inicia la liberación de enzimas hidrolíticas como la α-amilasa, para la hidrólisis del almidón en respuesta a la liberación de giberelinas por parte del embrión.(2)Las enzimas digieren las reservas alimenticias que están almacenadas en el endosperma, rico en almidón. Estas reservas se liberan en forma de azucares y aminoácidos, el escutelo los absorbe y los transporta a las regiones del embrión que están en desarrollo, de este modo el embrión obtiene los nutrientes que necesita para su crecimiento en el momento requerido.
La β-amilasa también ayuda en elproceso de degradación del almidón actuando desde el extremo no reductor de la cadena (exoamilasa), catalizando la hidrólisis del segundo enlace α-1,4 para producir maltosa. (3)
La lectura de diferentes genes puede generar enzimas de distinta estructura conformacional pero con una misma función, esta similitud entre enzimas se denomina isoenzimas.
Las isoenzimas se pueden diferenciar enlaboratorio por medio de una electroforesis, para ello existen dos tipos de isoenzimas, las que emigran a bajo punto isoeléctrico y las que emigran a alto punto isoeléctrico, esta característica permite estudiar en profundidad la acción de las enzimas.(4)
Para la visualización de proteínas se realiza una electroforesis nativa que consiste en una serie de técnicas para la separación individual deproteínas, complejos proteicos y supercomplejos. Interacciones proteína-proteína fijas y estables pueden ser detectadas dependiendo de las condiciones experimentales utilizadas (detergentes y soluciones amortiguadoras)
La absorbancia es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra, se utiliza para calcular la concentración y es proporcional al grosor de la muestra y a la densidad de esta, eneste caso la diferencia de pesos moleculares entre las distintas isoformas permitirá la cuantificación de las mismas.
En función a lo aprendido tendremos como objetivos principales, la cuantificación de α-amilasa en extracto de semillas de cebada por medio de espectrofotometría e identificar la α-amilasa de cebada mediante electroforesis nativa.
Materiales y métodos
Materiales:Semillas de cebada, Micropipetas, centrífuga, espectrofotómetro, tubos falcon, tubos de 1,5 mL, tubos de 0,5 mL, baño termorregulado, cubeta con hielo, cámara de electroforesis, buffer de carga, 5 mL gel separador 8% (2,35 mL agua destilada, 1,3 acrilamida, 1,3 mL Tris 1,5 M pH 8,8, 50 uL APS 10 %, 3 uL TEMED), 3 mL gel concentrador 5% (2,13 mL agua destilada, 500 uL acrilamida, 380 uL Tris 1 MpH 6,8, 30 uL APS 10%, 3 uL TEMED), Buffer electroforesis nativa (0.025% Tris 0.19 M glicina pH 8,8, H2O hasta completar 1000 mL), solución para teñir (Azul de Coomasie R-250 0,25%), Solución A (acetato de sodio 50 mM, pH 4,8, almidón soluble 0.03 %, NaCl 60 mM, CaCl2 20 mM), Solución B (KI : I2 = 6 :0,6 % (w/v), Solución C.
Método experimental:
1. Se extrajo la cubierta de las...
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